Effect of commercial starter cultures and native yeasts on ochratoxin a production by aspergillus westerdijkiae and penicillium nordicum in meat products

Processed meat products are of worldwide importance and, because of their intrinsic factors as well as the processing methods, they are highly prone to fungal and mycotoxin contamination. Ochratoxin A (OTA) is the most significant mycotoxin in processed meat products. Penicillium nordicum is considered to be responsible for OTA contamination of meat products, as it is highly adapted to salt and protein-rich matrices and is moderately psycrotrophic. However, another OTA-producing fungus, Aspergillus westerdijkiae, adapted to carbon-rich matrices such as cereals and coffee beans, has been recently associated with high levels of OTA in meat products. Several Lactic Acid Bacteria (LAB) and yeasts have been tested as biocontrol agents against P. nordicum growth and OTA production in meat products, with promising results, but none of the studies have considered A. westerdijkiae. The aim of this work was to evaluate in vitro the effect of a commercial starter culture used in sausage fermentation and four yeasts isolated from dry-cured sausage on these two OTA-producing fungi, both in terms of fungal growth and of OTA production, using different meat-based culture media as model systems. The mechanisms underlying the observed effect were also studied. For this purpose, C. krusei, C. zeylanoides, R. mucilaginosa, R. glutinis, a mix of these yeasts and the starter culture were co-inoculated with P. nordicum and A. westerdijkiae in industrial sausage, traditional sausage, and ham-based media, under conditions of water activity, salt concentration and temperature that mimic real conditions at beginning and end of sausage curing process. Fungal growth was determined by measuring colony diameter, and OTA production was quantified by HPLC-FLD after extraction with methanol. Yeasts where found to inhibit significantly the growth of both fungi. P. nordicum was unable to produce detectable OTA in both sausage-based media under any condition. In ham, yeasts reduced OTA production, while the starter culture significantly increased it. Unexpectedly, OTA production by A. westerdijkiae was significantly stimulated in all media tested by all microorganisms. Matrix has a significant effect on OTA production by P. nordicum, but not by A. westerdijkiae, for which only temperature showed to have effect. By testing the mechanisms of action by which starter culture and C. zeylanoides influenced fungal responses, we were able to determine that direct contact and simultaneous growth of test organisms were the mechanisms more significantly involved in the responses. In conclusion, ochratoxigenic fungi do not all respond to antagonistic microorganisms in the same way. The use of biocontrol agents with the intent of reducing fungal growth and mycotoxin production by one fungus can have unexpected effects on others, thus leading to unforeseen safety problems. Further experiments are recommended to properly understand the reasons behind the different effects of microorganisms, to ensure their safe as biocontrol agents.Os produtos processados de origem animal assumem importância mundial e, devido às suas características intrínsecas e métodos de processamento, são geralmente muito expostos a contaminação por fungos e micotoxinas. Ocratoxina A (OTA) é uma das micotoxinas de maior relevância nestes produtos alimentares, sendo Penicillium nordicum o fungo considerado responsável pela contaminação de produtos cárneos, devido à sua elevada adaptabilidade a matrizes ricas em proteína e sal. No entanto, o fungo Aspergillus westerdijkiae, reconhecidamente adaptado a matrizes vegetais ricas em carbono, foi recentemente associado a elevados níveis de OTA em presunto. Várias Bactérias do Ácido Láctico e leveduras foram anteriormente testadas como agentes de biocontrolo contra P. nordicum, mas nenhum destes estudos considerou o efeito desses microrganismos em A. westerdijkiae em matrizes cárneas. O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro o efeito de uma cultura iniciadora (starter) comercial usada na fermentação de chouriço e de quatro leveduras previamente isoladas de chouriço português no crescimento e produção de OTA por estes dois fungos, usando meios de cultura de produtos cárneos com modelo. Os mecanismos de ação destes microrganismos teste sobre os fungos foram também analisados. C. krusei, C. zeylanoides, R. mucilaginosa, R. glutinis, a mistura destas leveduras e a cultura iniciadora foram co-inoculadas com P. nordicum e A. westerdijkiae em meio de chouriço industrial, chouriço tradicional e presunto, sob condições de atividade de água, concentração de sal e temperatura que refletiam as condições de cura destes produtos. O crescimento dos fungos e a produção de OTA nas várias condições testadas foram avaliados por medição do crescimento da colónia e por quantificação por HPLC-FLD, respetivamente. As leveduras reduziram significativamente o crescimento dos fungos. P. nordicum apenas produziu OTA detetável em presunto. Neste meio, as leveduras inibiram a produção de OTA por P. nordicum, enquanto a starter estimulou de forma significativa a sua produção. Inesperadamente, foi também observada a estimulação significativa da produção de OTA por A. westerdijkiae por todas as culturas testadas em todos os meios de cultura. O efeito de matriz foi significativo para P. nordicum mas não para A. westerdijkiae, para o qual apenas a temperatura teve efeito significativo. O efeito das culturas testadas no crescimento e produção de OTA pelos fungos parece ser principalmente resultado do contacto direto e crescimento simultâneo do microrgnismo teste e fungo. Em conclusão, os fungos ocratoxigénicos parecem não responder de forma igual aos microrganismos antagónicos. O uso de agentes de biocontrolo com o objetivo de reduzir o crescimento e produção de micotoxinas por determinado fungo pode ter efeitos indesejados sobre outros fungos, conduzindo a perigos alimentares imprevistos. É assim recomendado o desenvolvimento de mais estudos que permitam compreender as razões por detrás dos efeitos dos microrganismos controlo sobre os fungos, de forma a assegurar a segurança na sua utilização como agentes de biocontrolo