Label‐free Optical Biosensors based on Resonant Nanopillars

El trabajo de investigación desarrollado en esta tesis está centrado en la obtención de un biosensor óptico, que no necesite amplificación química (sin marcado), que tenga alta sensibilidad y un coste bajo. Este biosensor está basado en redes de nanopilares resonantes (R‐NPs) compuestos por pares de Reflectores de Bragg de nitruro de silicio y óxido de silicio (Si3N4/SiO2) y una cavidad central de óxido de silicio (SiO2), dispuestas sobre un sustrato de cuarzo. Un nanopilar resonante tiene una respuesta óptica que consiste en una banda espectral que impide la transmisión de la luz (gap fotónico) salvo en un rango concreto de dicha banda, donde la luz se transmite (resonancia), debido a la cavidad central. La luz es guidada por cada R‐NP que, debido a su carácter nanométrico, hace que parte de la luz viaje por fuera del nano‐pilar observando lo que hay en su superficie, lo que se conoce como detección por campo evanescente. Aunque cada R‐NP actúa como un único nanosensor, sería muy complicado observar la respuesta de un solo R‐NP debido a su reducido tamaño, por ello se realizan redes o matrices de estos nanosensores, cuya proximidad produce un efecto de concentración de luz fuera de la superficie de los R‐NPs, a este fenómeno se le conoce como concentración de la luz por campo evanescente. Además, estas celdas permiten que una muestra biológica líquida se infiltre en la matriz formada por los nasnosensores, y por ende se puedan observar: por un lado el cambio de las propiedades ópticas del líquido, y por otro, la inmobilización de un bioreceptor y las reacciones de afinidad entre el bioreceptor mencionado y la molécula objetivo a detectar (analito). Uno de los desarrollos llevados a cabo en esta tesis es la fabricación de los R‐NPs, siendo agrupados en celdas dispuestas en distintas zonas de un mismo chip, que, una vez tapizadas con el bioreceptor, se llamarán BICELLs (de su traducción al inglés Bio Photonic Sensing Cells). Esta distribución, dota a los R‐NPs la posibilidad de ser utilizados como sensores con alta capacidad de multiplexación o capacidad para poder detectar muchas biomoléculas diferentes en un mismo chip. Además de su diseño, fabricación y caracterización, en este trabajo se analiza el rendimiento de los R‐NPs para ser utilizados como sensores químicos, ya que, mediante un conjunto de experimentos de sensado de las propiedades ópticas del líquido inflitrado (bulk sensing) se puede observar que las redes de nano‐sensores tienen capacidad para diferenciar pequeños cambios en el índice de refracción del medio que les rodea, siendo así ideales para poder distinguir diferentes components del líquido y correlacionarlo con propiedades como la densidad, la viscosidad, la turbidez, entre otras. También se ha probado la capacidad de los R‐NPs para detectar la inmovilización de los biorreceptores y el posterior reconocimiento específico del analito. Para ello, se trabaja en la modificación de la superficie de los R‐NPs y en distintos protocolos de biofuncionalización. En este sentido se observa que efectivamente, son capaces de inmovilizar biomoléculas y detectar analitos, ya sea en ambiente seco, o inmersos en el medio de transporte. Sin embargo, se concluye que la sensibilidad de los R‐NPs aumenta más de diez veces cuando éstos son interrogados en medio seco. Este efecto es principalmente debido a que el contraste de índice de refracción que existe entre el aire (medio seco) y los R‐NPs es mucho mayor al contraste de índice de refracción que existe entre el agua (medio húmedo) y los R‐NPs. Otra conclusión extraída del trabajo es que el pre‐tratamiento de la de la superficie de los R‐NPs es clave para alcanzar una biofuncionalización óptima en la que se maximice la detección del analito en cuestión. ----------ABSTRACT---------- The research work developed in this thesis is focused on obtaining an optical biosensor, which does not need chemical amplification (label‐free), which has high sensitivity and is cost efficiency. This biosensor is based on arrays of resonant nanopillars (R‐NPs), composed of pairs of Bragg reflectors of silicon nitride and silicon oxide (Si3N4/SiO2) and a central cavity of silicon oxide (SiO2) arranged on a quartz substrate. A resonant nanopillar has an optical response consisting of a spectral band gap that prevents the light transmission (photonic gap) except in a specific range of the band, where the light is transmitted (resonance), due to the central cavity. The light is guided by each R‐NP, and due to their nanometric character, part of the light travels outside of the nanopillar, observing thus, what is on the surface. This is known as evanescent field detection. Although each R‐NP acts as a single nanosensor, it would be very difficult to observe the response of a single R‐NP because of its small size, so R‐NPs are arranged into arrays. Their proximity produces an effect of light concentration outside of the surface of the R‐NPs. This phenomenon is known as concentration of light by evanescent field. In addition, this arrays, allow biological sample to infiltrate the matrix formed by the R‐NPs, and thus they can observe: on one hand the change in the optical properties of the liquid, and on the other hand, the immobilization of a bioreceptor, and the affinity reactions between such bioreceptor and the target molecule to be detected (analyte). One of the developments accomplished in this thesis is the fabrication of the R‐NPs, being grouped in cells or arrays arranged in different zones of the same chip that, once immobilized with the bioreceptor, will be called BICELLs (Bio Photonic Sensing Cells). This distribution, gives R‐NPs the possibility of being used as sensors with high multiplexing capacity, to be able to detect different biomolecules in the same chip. Besides to the design, fabrication and characterization, this work, analyzes the performance of R‐NPs to be used as chemical sensors, since, through a set of sensing experiments of the optical properties of the infiltrated liquid (bulk sensing), it can be observed that the R‐NPs have the capacity to differentiate small changes in the refractive index (RI) of the media surrounding them. Being just ideal to be able to distinguish different components of the liquid and correlate them with properties such as density, viscosity, and turbidity, among others. Also, it has been shown, the ability of the R‐NPs to detect the immobilization of the bioreceptors and the subsequent specific recognition of the analyte. To do this, work was addressed to the surface modification of the R‐NPs as well as to different biofunctionalization protocols. In this sense, it has been observed that R‐NPs are effectively able to immobilize biomolecules and detect analyte, either in dry conditions or immersed in the transport medium. However, it is concluded that the sensitivity of the R‐NPs increases more than ten times when they are interrogated in dry conditions. This effect is mainly due to the fact that the refractive index contrast between air (dry conditions) and R‐NPs is much higher than, that, between the humid medium and R‐NPs. Another conclusion drawn from the work is that the pre‐treatment of the surface of the R‐NPs is a key factor to achieve an optimal biofunctionalization in which the detection of the analyte is maximized