Bacterial communities associated with the lichen Ramalina farinacea (L.) Ach.: composition, biodiversity and biotechnological potential

Los líquenes son un ejemplo clásico de asociación simbiótica autosuficiente, compuesta por, al menos, un hongo filamentoso (micobionte, heterótrofo) y cianobacterias y/o algas verdes unicelulares (fotobiontes, fotosintéticos). Se desarrollan gracias a la combinación adecuada de hongos y algas y/o cianobacterias, y sus talos son los fenotipos resultantes (holobiontes). Dicha asociación les permite colonizar y crecer en ambientes diversos y extremos que no podrían habitar los simbiontes de forma independiente. Estudios recientes, mediante aproximaciones ómicas, han revelado la gran abundancia y diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a los líquenes. Estos estudios han cambiado la visión clásica de las simbiosis liquénicas, de modo que la definición de liquen se ha extendido para englobar a las bacterias. Sin embargo, apenas se conoce la composición, potencial metabólico y diversidad de las bacterias asociadas a los líquenes. Dicha información es necesaria para conocer y comprender sus papeles funcionales en las simbiosis liquénicas, pero también por su potencial biotecnológico. En base a dichos antecedentes, los objetivos de la presente Tesis Doctoral han sido: 1. Aislar y caracterizar metabólica y fisiológicamente una colección de cepas bacterianas a partir de poblaciones de R. farinacea de distintas zonas geográficas españolas, tanto por su posible contribución a la simbiosis liquénica como -con especial interés- por su potencial biotecnológico, así como iniciar la identificación molecular de las cepas bacterianas de mayor interés biotecnológico. 2. Estudiar la composición y diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a las distintas poblaciones de R. farinacea estudiadas, mediante técnicas dependientes del cultivo, y determinar la influencia del origen geográfico o la localización en el talo liquénico (ecto- o endoliquénica). 3. Analizar la composición y diversidad de las comunidades bacterianas asociadas a las mismas poblaciones de R. farinacea mediante técnicas independientes del cultivo, así como investigar la influencia de la localización geográfica o en el talo (ectoliquénica o endoliquénia, o bien apical, media y basal), así como el efecto de un tratamiento de desinfección. Los resultados finales de la extensiva caracterización de las bacterias cultivables asociadas a R. farinacea de diferentes zonas geográficas llevadas a cabo en este estudio, son un ejemplo de la complejidad tanto funcional como de diversidad de las bacterias asociadas a líquenes. Estas bacterias, en vista a los resultados obtenidos, podrían estar implicadas en numerosos y diversos papeles funcionales, mediante la provisión de nutrientes al resto de miembros simbiontes tales como nitrógeno, fosfatos y hierro, así como del aprovechamiento y reciclaje de otras macromoléculas como diferentes polisacáridos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Además, podrían estar implicadas en el aporte de diferentes factores reguladores del crecimiento, así como la protección mediante la formación de biopelículas, mostrando así la importancia de estas actividades bacterianas en la simbiosis liquénica, además de las posibles numerosas aplicaciones biotecnológicas de estas bacterias con estas actividades. Los resultados de este estudio proveen, además, nuevos datos sobre la diversidad de las comunidades bacterianas asociadas con las poblaciones de R. farinacea de diferentes áreas de clima Mediterráneo, mostrando que ciertos fila, como Acidobacteria, Proteobacteria y Planctomycetes y clases como Actinobacteria, Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria y Bacilli, son los grupos predominantes en esta especie de liquen. Además, estas comunidades bacterianas se encuentran principalmente determinadas por la geografía, así como localización en el talo, tanto ectoliquénicas y endoliquénicas como en las zonas apical, media y basal. Finalmente, cabe destacar que, entre todos los taxones identificados, muchos de ellos pertenecen a grupos bacterianos con cepas cultivables bien estudiadas debido a sus actividades enzimáticas y/o potenciales papeles en el aporte de nutrientes y/o el reciclaje en las partes senescentes, contribuyendo así a la simbiosis liquéncia multiespecie, muchos de ellos identificados y caracterizados en la presente Tesis Doctoral.Lichens are a classical example of a self-sufficient symbiotic association, composed of, at least, a filamentous fungus (mycobiont, heterotrophic) and cyanobacteria and/or green unicellular algae (photobiont, photosynthetic). They develop under the appropriate combination of fungus and algae and/or cyanobacteria, and their thallus are the resulting phenotype (holobionts). This association allows them to colonize and grow in diverse and sometimes extreme environments which won’t be able to inhabit in a free-living state. Recent studies, mostly through omic approaches, have revealed a high abundance and diversity in the bacterial communities associated with lichens. These studies have change the classical view of the lichen symbiosis, thus the lichen definition has been expanded to include bacteria. Nevertheless, few is known about the composition, metabolic potential and diversity of bacteria associated with lichens. This information is necessary in order to know and understand their functional roles in the lichen symbiosis, but for their biotechnological potential as well. Based on these background, the objectives of this Doctoral Thesis have been: 1. To isolate and characterize physiologically and metabolically a collection of bacterial strains from populations of R. farinacea from different geographical Spanish locations, either for their possible contribution to the lichenic symbiosis and -with special interest- for their biotechnological potential, as well as to initiate a molecular identification of the isolated strains of most biotechnological interest. 2. To study the composition and diversity of the bacterial communities associated with the different populations of R. farinacea studied, through culture-dependent techniques, and to determine the influence of the geographical origin or the location in the lichen thallus (ecto- or endolichenic). 3. To analyze the composition and diversity of the bacterial communities associated with the same populations of R. farinacea through culture-independent techniques, as well as to investigate the influence of geography, the location in the lichen thallus (ectolichenic or endolichenic, or apical, middle and basal) and the effect of a disinfection treatment. Final results about the extensive characterization of the R. farinacea associated culturable bacteria from different geographical locations carried out in this study, are an example of the complexity, functional and in diversity, of the lichen-associated bacteria. These bacteria, according to the results obtained, could be involved in numerous and diverse functional roles, through the provision of nutrients to other symbiotic members, such as nitrogen, phosphate and iron, as well as the recycling and exploitation of other macromolecules as different polysaccharides, lipids, proteins and nucleic acids. Furthermore, they could be involved in the supply of different growth promoting factors, as well as the biofilms production, showing the importance of these bacterial activities in the lichen symbiosis and, besides, the numerous biotechnological applications of these bacterial activities. Furthermore, the results obtained in this study provide new data about the diversity of the bacterial communities associated with the different lichen populations of R. farinacea from Mediterranean climate areas, showing that, certain phyla, as Acidobacteria, Proteobacteria and Planctomycetes and classes as Actinobacteria, Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria and Bacilli, are the predominant groups in this lichen species. Besides, these bacterial communities are determined, mostly, by their geography, as well as the location in thallus, either ectolichenic and endolichenic as in the apical, middle and basal part. Finally, it is important to point out that, among the bacterial taxa identified, many of them belong to bacterial groups with culturable strains well studied because of their enzymatic activities and/or their biotechnological potential roles in the supply and/or recycling in the senescing parts of the lichen, contributing to the lichen multi-species symbiosis, many of them identified and characterized in this Doctoral Thesis