短散在核重复序列（SINEs）的分离及在鲤科鱼类系统进化研究中的应用

短散在核重复序列（short interspersed elements SINEs）是广泛分布于真核生物基因组内的中度重复序列，分子长度在70-500bp，在基因组内的拷贝数为103-105；SINEs在基因组内以返转座的方式进行增殖，由RNA聚合酶III转录成RNA，再反转录成cDNA插入到基因组内。SINEs插入基因组后，很难在其相同位点精确的去除，能相对稳定地遗传；因此为系统进化分析提供了良好的分子标记，并被认为在物种50Mys的进化事件上能提供比较可信的进化信息，尤其是在科属以下的物种中。 鲤科鱼类是世界上现生鱼类中最大的一个科，约有210属2010个种，但有关鲤科鱼类中SINEs的研究却很少，目前相关的报道仅限于斑马鱼基因组内；而有关利用SINEs插入位点信息进行鲤科鱼类系统进化的研究更没有报道。本研究基于这些问题，开展了鲤科鱼类中SINEs的研究工作，并得到如下结果： 1 在A-B PCR方法的基础上，以鲤科鱼类中的马口鱼为对象，利用反向PCR方法，建立了分离SINEs的简便方法。马口鱼的基因组DNA利用HaeIII酶切后，利用T4连接酶进行自环化；环化后的DNA分子在反向引物的引导下执行反向PCR，最后，一组衍生于tRNA的SINEs从马口鱼基因组内获得，并根据马口鱼的学名Opsariichthy bidens命名为Opsar。Opsar有典型SINEs的特征：在5′端是一个tRNA衍生区的头部；中部是tRNA非相关区；AT富含区定位到3′端。通过序列分析发现，tRNA衍生区与丙氨酸tRNA基因有76％的相似性，二级结构也有非常相似的构型，Opsar有可能衍生于丙氨酸tRNA基因。基于反向PCR分离SINEs的方法用到草鱼、鲤鱼、鲂鱼中，很成功的得到了C-SINE、Ct-SINE和M-SINEs家族，使该方法的可信性得到证实。与已有分离SINEs的方法相比，该方法非常简单，成功地省去了制备探针、杂交、构建基因组文库和细胞培养等繁琐的工作。 2 在得到Opsar的基础上，我们在斑马鱼基因组数据库中获得了没有注释的Zb-SINEs家族，根据Zb-SINEs序列5′端tRNA衍生区的特征，Zb-SINEs可分为Zb-SINE -A和Zb-SINE-B两种类型。Zb-SINE-A包括-A1、-A2、-A3、-A4和-A5成员，它们有单一的tRNA衍生区；而Zb-SINE-B只有一个成员，其5′端是tRNA衍生区的二聚体。Zb-SINEs家族也可分为三部分，tRNA衍生区、tRNA非相关区和AT富含区；两端的正向重复也富含AT碱基。tRNA衍生区也与丙氨酸tRNA基因有76％的相似性，可能衍生于其相似序列。Zb-SINEs的平均长度为340bp，所有的拷贝数在斑马鱼基因组内占有的比例大约为0.1%。Zb-SINEs的染色体定位显示：Zb-SINEs几乎分布在所有染色体上，尤其是第11、18和19号染色体，几乎包括了所有类型的Zb-SINEs。利用Bayesian程序分析了整个家族在基因组内的分布模式，其结果强烈支持了主基因模式的增殖方式。同时也利用PCR和点杂交验证了Zb-SINEs在斑马鱼基因组内的物种特异性；由此结合斑马鱼在鲤科鱼类家族中的进化地位，推测Zb-SINEs应该是一个非常古老的短散在核插入序列。 3 我们利用Opsar、Zb-SINEs、C-SINE、Ct-SINE和M-SINEs做分子标记，结合细胞色素b基因的全序列，分析了鲤科鱼类的进化关系。细胞色素b基因和SINEs插入事件的分析结果显示了极其相似的结果，在大的分类上都支持了陈湘粦和Howes基于形态学的分类结果，把整个鲤科鱼类分为雅罗鱼系和鲃系；对比研究的不同之处在于野鲮亚科的系统地位；SINEs插入事件的分析结果显示了该亚科比较原始，而细胞色素b基因序列的结果则显示相对较晚起源的进化地位。尽管我们在这次研究中仅分析了部分物种，但为SINEs在鲤科鱼类插入事件的分析提供了很好的数据。 4 基于A-B PCR的结果，我们合成探针来验证A-B PCR分离SINEs的方法。通过探针文库的斑点杂交结果，在马口鱼基因组内获得了ToL2和Tc1两类转座子。Blastn搜索显示：ToL2长度为239bp，与日本青鳉鱼类基因组的转座子有很高的相似性；Tc1长度为1342bp，在序列比对上，显示了与斑马鱼基因组内Tc1序列有高的相似性。这两种转座子都已被用于系统进化的研究，它们在马口鱼基因组内的再次发现，很可能为东亚特有鱼类的物种进化研究提供很好的分子标记