Métodos de detecção e caracterização molecular de Streptococcus mutans

Orientadora : Profª. Drª. Vânia Aparecida VicenteTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 24/07/2012Inclui referências ao final de cada capítuloResumo; A cárie é uma doença infecciosa, determinada por diversos fatores endógenos e exógenos ao indivíduo. O principal agente etiológico relacionado à doença é a bactéria Streptococcus mutans, devido a fatores de virulência como capacidade de aderir-se ao esmalte dental e propiciar a formação do biofilme dental, através da produção de polissacarídeos extracelulares. Os exopolissacarídeos, que são glucanos sintetizados a partir da enzima glicosiltranferase, promovem sítios de acumulação de microrganismos na superfície dental, e são enzimaticamente ativos quando expostos a sacarose da dieta. Dentro deste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi caracterizar S. mutans por meio de marcador molecular, utilizando o sequenciamento parcial do gene gtfB que codifica a enzima Betaglicosiltransferase, e detectar o microrganismo por meio de sonda baseada na metodologia de amplificação em círculos rolantes (Rolling Circle Amplification - RCA). Para o isolamento do DNA genômico de bactérias do gênero Streptococcus, dois métodos de extração utilizando brometo de cetil trimetil amônio (CTAB) foram testados. O método que associou o ultrasson à sílica e celite foi mais eficiente. Com o objetivo específico de identificar a variabilidade genética e a relação de isolados de S. mutans com o perfil de colonização e epidemiologia da doença cárie na população infantil, linhagens isoladas da saliva de crianças com diferentes históricos de cárie, foram caracterizadas por marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), e sequenciamento de regiões específicas do gene que codifica a enzima Beta-glicosiltransferase (gtfB). Os resultados demonstraram que a variabilidade genética dos isolados pode estar relacionada ao padrão de virulência, justificando assim, as variações observadas nos níveis de colonização dos indivíduos e manifestação clínica da doença. Com o objetivo de identificar a transmissibilidade intrafamiliar de S. mutans isolados procedentes de saliva de indivíduos pertencentes a duas famílias de alto risco biológico e social, previamente caracterizados por marcadores RAPD, foram estudados quanto à variabilidade genética de uma região do gene que codifica a enzima Beta-glicosiltransferase (gtfB). Os resultados revelaram transmissibilidade de isolados intrafamiliar e relação entre sorotipos e virulência. Visando estabelecer um método de detecção direta para S.mutans, uma sonda cadeado (padlock) RCA foi desenvolvida a partir de sequências intergênicas 16S-23S rDNA de S. mutans, e associada ao método de amplificação isotérmica do DNA total em círculos rolantes (RCA). A sonda foi testada em diferentes amostras de DNA, incluindo isolados S. mutans procedentes de indivíduos com diferentes históricos da doença, linhagens referência do gênero, além de amostras de biofilme dental e saliva. O método demonstrou ser efetivo para a detecção de S.mutans, apresentando alta especificidade em relação a outras espécies do grupo mutans. Palavras-chave: Streptococcus mutans; cárie; RAPD; região intergênica; gtfB; RCA; sonda padlock.Abstract: Dental caries is an infectious disease that can be greatly affected by the endogenous and exogenous conditions within each individual host. The main etiological disease - related agent is the bacterium Streptococcus mutans, due to its virulence factors such as ability to adhere to the tooth's enamel and lead to biofilm formation, through the production of extracellular polysaccharides. Exopolysaccharides, which are glucans synthesized from the enzyme Glucosyltransferases, promote the accumulation of microorganisms at specific sites on dental surfaces and become enzymatically active when exposed to dietary sucrose. In this context, the aim of this study was to characterize S. mutans through molecular markers, by using the partial sequencing of the gtfB gene and detect the microorganism using probe-based RCA methodology. In this work, genomic DNA from Streptococcus bacteria was isolated through two methods of extraction using cetyltrimethylammonium bromide detergent (CTAB). The composite method that used ultrasound was the most efficient, allowing the straightforward extraction of genomic DNA from Gram-positive bacteria with good quality and reproducibility. In order to characterize the genetic variability of various S. mutans isolates and to correlate this variability with different colonization profiles observed during dental caries in a sample of children, S. mutans samples were isolated from saliva of children with several histories of dental caries. Initially selected by RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markers, they were characterized by sequencing a specific region of the gene encoding the enzyme betaglucosyltransferase (gtfB).The results indicated the existence of genetic variability that could be related to the virulence pattern, thus justifying the variations observed in the levels of colonization of individuals and clinical manifestation of the disease. The specific aim was identifying the intrafamilial transmission of salivary isolates of S. mutans in individuals belonging to two families with high biological and social risk. Initially characterized by RAPD markers, those S. mutans were characterized by genetic variability of a specific region of the gene encoding the enzyme betaglucosyltransferase (gtfB). The results revealed the transmissibility among isolates within families and relationship between sorotipes and virulence. Aiming to establish a direct detection method for S. mutants, a padlock-RCA (Rolling circle amplification) probe was developed from the sequence analysis of intergenic 16S-23S rDNA of S. mutans, associated with the isothermal method of Rolling Circle Amplification (RCA) of the total DNA. The probe was tested in different samples of DNA, including isolates of S. mutans proceeding from individuals with different disease history, reference strains of the genus, beyond biofilm and saliva samples. The method was effective for detection of S. mutans isolates, with high specificity in relation to other species of mutans group. Key words: Streptococcus mutans; caries; RAPD; intergenic region; gtfB; RCA; padlock probe