Phenotyping of resistance sources and characterisation of resistance factors in Brassica species to Sclerotinia sclerotiorum, the causal pathogen of the white mold disease.

Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des internationalen PLANT-KBBE III -Verbundvorhabens MONARCH (Resistenz von Brassica napus gegen Weißstängeligkeit – eine Herausforderung, Teilprojekt B) durchgeführt. Die Projektaufgaben beinhalteten die Identifizierung neuer Resistenzquellen in dem Genus Brassica und die Charakterisierung resistenzbedingter Abwehrreaktionen. Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit war die Bewertung von Resistenzreaktionen verschiedener Brassica-Arten gegenüber S. sclerotiorum. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden bereits bekannte Inokulations-, Screening- und Resistenzbewertungsmethoden evaluiert und optimiert. Im Gewächshausscreening wurde neben der Läsionsausbreitung auch der Penetrationserfolg von S. sclerotiorum bewertet. Da über die bisherigen Resistenzbewertungsstandards - Läsionslänge nach unverletzter Inokulation und Inokulationseffizienz - nur eine unzureichende Differenzierung der getesteten Brassica-Arten bezüglich ihrer Resistenz gegen S. sclerotiorum im Versuchsjahr 2012 möglich war, wurde eine neue Inokulationsmethode entwickelt und im Gewächshausscreening von 2013 angewandt. Hierfür wurden Stängel der zu untersuchenden Pflanzen vor der Inokulation mit Myzel von S. sclerotiorum verletzt und anschließend die sich entwickelnden Stängelläsionen mit denen unverletzter Inokulationen verglichen. Durch die zugeführte Verletzung wurde eine hundertprozentige Infektionsrate erreicht. Außerdem ließ der Vergleich mit der unverletzten Inokulationsvariante Rückschlüsse auf die jeweiligen Abwehrprozesse, Penetrations- und Ausbreitungsabwehr, zu. Durch die Etablierung dieses neuen Screeningverfahrens konnte eine verbesserte Differenzierung verschiedener Brassica-Arten bezüglich ihrer Resistenz gegen S. sclerotiorum vorgenommen werden. Die Befallsabwehr der hier eingesetzten Rapssorten sowie einiger domestizierter Brassica-Akzessionen beruhte im Wesentlichen auf der Verhinderung der erfolgreichen Penetration des Pathogens aufgrund präformierter oder induzierter Mechanismen. Hingegen konnte bei den meisten wilden Brassica-Akzessionen die Ausbreitung von S. sclerotiorum in der Pflanze nach erfolgreicher Infektion reduziert werden. Von den untersuchten Brassica-Wildarten kristallisierten sich B. drepanensis und B. macrocarpa aus dem Gewächshausscreening von 2013 heraus. Sie zeigten sowohl mit als auch ohne Verletzung einen geringen Befall durch das Pathogen, welcher auf verstärkte, präformierte und induzierte Penetrations- und Ausbreitungsabwehrreaktionen zurückzuführen ist. Aufgrund der erfolgreichen Pathogenabwehr stellen die beiden Brassica-Wildarten geeignete Kandidaten für weitere Untersuchungen dar. Hierbei sollte der Fokus der Untersuchungen auf der induzierten Ausbreitungsresistenz liegen, welche für die Resistenzzüchtung gegen S. sclerotiorum am interessantesten scheint. Um Mechanismen zur Ausbreitungsabwehr zu bestätigen, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit ein weiteres Screening der verwendeten Brassica-Arten über einen Blattsegmenttest, welcher die Sensitivität der Genotypen gegenüber Oxalsäure bewertete. Trotz einer Optimierung des Testes konnten hierbei allerdings keine reproduzierbaren Ergebnisse erbracht und auch keine Übereinstimmung mit dem Gewächshausscreening erzielt werden. Deshalb wird dieser Test mit der hier angewandten Methodik als ungeeignet eingestuft. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der sekundären Zellwand sowie deren Veränderungen bei der Interaktion zwischen Raps und S. sclerotiorum zu beurteilen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde zuerst ein Genotypenset von B. napus identifiziert, welches Unterschiede in der Resistenzausprägung gegen den Weißstängeligkeitserreger aufwies. Anschließend sollten genetische, biochemische und histologische Untersuchungen Aufschluss über Veränderungen in der Zusammensetzung der sekundären Zellwand dieser Rapstypen geben. Das verwendete B. napus Set bestand aus der chinesischen Rapslinie Zhongyou 821, welche sich als äußerst resistent erwies, und dem Sommerraps Loras als anfälliger Sorte. In den Gehalten von Cellulose und Pektin zeigten sich keine gravierenden Unterschiede zwischen den beiden Genotypen und Behandlungen. Allerdings schien Zhongyou 821 mehr Hemicellulose in die Zellwand eingelagert zu haben. Nach Infektion zeigten beide Genotypen eine signifikante Abnahme in ihren Zellwandzuckergehalten. Diese beruhte auf dem Befall durch S. sclerotiorum, welches die freigesetzten Zuckereinheiten direkt als Nährstoffquelle nutzen kann. Eine Verwendung der freien Zuckermoleküle als Kohlenstoffquelle für die Synthese von Phenylpropanoiden zur Abwehr des Befalls wäre ebenfalls möglich. Diese Annahme wurde durch die durchgeführten genetischen und histologischen Untersuchungen bestätigt. Die Analysen ergaben hierbei, dass die Abwehr von S. sclerotiorum mit einer erhöhten und schnelleren Synthese von Phenylpropanoiden und Lignin einhergeht. In der resistenten Rapslinie kam es bereits zum frühen Infektionszeitpunkt zu einer raschen Hochregulation der Expression von Schlüsselgenen des Phenylpropanoidsyntheseweges, während bei der anfälligen Sorte die Expression erst zum späteren Befallszeitpunkt erhöht wurde. Zusätzlich konnte in Zhongyou 821 eine erhöhte Expression des Gens für die Ferulat-5-Hydroxylase (F5H) zu Beginn des Befalls beobachtet werden, was mit einer verstärkten Einlagerung von Syringyl (S)-Lignin einherging. In der anfälligen Sorte Loras konnte weder auf genetischer noch auf histologischer Ebene eine Verstärkung der Zellwände durch S-Lignin nach Infektion mit S. sclerotiorum beobachtet werden. Beide Genotypen zeigten eine erhöhte Expression des Gens für die Cinnamoyl-CoA Reduktase 2 (CCR2), ein Enzym, das für die Synthese der Vorstufen von Guaiacyl (G)-Lignin verantwortlich ist. Zusätzlich zeigten die histologischen Untersuchungen eine erhöhte G-Lignineinlagerung in die Zellwände der Xylemgefäße der beiden Genotypen nach Infektion mit S. sclerotiorum. Ferner konnten in den Zellwänden und Interzellularen des Parenchymgewebes von Zhongyou 821 vermehrt G-Lignifizierungen beobachtet werden. Die Verdickungen der Zellwände über Lignin führen möglicherweise zu einer Reduktion der invasiven Ausbreitung des Pathogens sowie zur Hinderung der systemischen Diffusion von Oxalsäure. Zusammenfassend kann aus den durchgeführten Untersuchungen gefolgert werden, dass bei der Interaktion zwischen B. napus und S. sclerotiorum die Abwehr über Zellwandmodifikationen eine wichtige Rolle spielt. Diese Erkenntnisse ermöglichen neue Einblicke in die Wirt-Pathogen-Beziehung und bieten neue züchterische Ansätze für die spezifische Resistenzselektion.The present study was part of the international PLANT-KBBE III – joint research project MONARCH (White Mold Brassica napus Resistance Challenge, subproject B). The project assignment included the identification of new resistance sources in the genus Brassica and the characterization of resistance responses. The evaluation of resistance reactions of diverse Brassica species against infection with S. sclerotiorum was a main objective of the present work. For this purpose previous established methods for inoculation, screening and disease assessment were applied and optimized. Beside the lesion expansion also the penetration success was rated in greenhouse screenings. Due to the insufficient resistance differentiation of Brassica species in the screening of 2012 using two disease assessment methods - lesion length after uninjured infection and inoculation efficiency - a new inoculation technique was developed and used for the greenhouse screening in 2013. Therefore stems of studied plants were injured before inoculation with mycelia of S. sclerotiorum and the measured lesion lengths were compared to the lesion expansion of the uninjured inoculations. The conducted injury led to one hundred percent infection and from the contrast of injured and uninjured lesion expansion conclusions were drawn regarding the defence mechanisms against pathogen penetration and pathogen spread in the plants. Based on the new screening procedure an improved differentiation between the resistances of the tested Brassica species was achieved. The disease defense of the used oilseed rape cultivars and some domesticated Brassica accessions was based on preformed or induced defense mechanisms preventing the invasion of the pathogen into the stem tissue. In contrast most wild Brassica species can restrict the pathogen from spreading inside the infected plant tissue as a result of triggering postinfectional induced defense mechanism. Two candidates for further investigations are the wild type Brassica species B. drepanensis and B. macrocarpa which showed increased defense responses after infection with S. sclerotiorum with and without injury. These two wild types have elevated defense mechanisms and seem to be adequate sources for the resistance breeding. To confirm the existance of enhanced defense mechanisms against pathogen expansion a detached leaf segment test was carried out to screen the different Brassica species for their sensitivity to the presence of oxalic acid. Despite optimization neither reliable and reproducible results nor any analogy with the results of the greenhouse screening could be generated. Therefore the detached leaf segment test was declared inappropriate in the present study. The second major objective of this work was to evaluate the role of the secondary cell wall in the interaction between oilseed rape and S. sclerotiorum. For this purpose a genotype set of two B. napus types contrasting in their resistance reaction to the pathogen was identified and subsequently investigated biochemically, genetically and histologically. The B. napus set consisted of the Chinese rapeseed line Zhongyou 821, which showed increased resistance and the spring oilseed rape cultivar Loras as susceptible standard. The biochemical analysis of the concentration of cellulose and pectin revealed no significant differences between the two genotypes or the Mock/Sclerotinia inoculated treatment. However, the hemicellulose content seemed to be more elevated in the resistant genotype Zhongyou 821. After infection with the pathogen both genotypes showed a reduction of hemicellulose. This could be due to the fact that S. sclerotiorum uses the sugar monomers as a carbon source for nutrition. Another reason may be the metabolic conversion of sugar monomers for the synthesis of phenylpropanoids. The genetic and histological analysis revealed that defense response to infection with S. sclerotiorum results in an elevated and rapid synthesis of phenylpropanoids and lignin. The interaction of the resistant genotype showed a quick activation of gene expression during early stages of infection while the gene expression of the susceptible interaction type was up-regulated at later infection stages. Additionally elevated gene expression of the ferulate-5-hydroxlase (F5H) was detected in Zhongyou 821 at the beginning of infection as well as increased incorporation of syringyl (S)-lignin in the intervascular fibers. In the susceptible genotype Loras no enhanced gene expression after infection with S. sclerotiorum was detected. Histological staining neither revealed stronger S-lignin synthesis or accumulation in Loras after infection with S. sclerotiorum. Both genotypes showed an elevated gene expression of the cinnamoyl-CoA reductase (CCR2), an enzyme catalyzing the synthesis of guaiacyl (G)-lignin precursors. In addition histological examinations indicated stronger G-lignin incorporation in the cell wall of xylem vessels of both interaction types. In the resistant rapeseed line Zhongyou 821 increased lignifications of G-lignin could be detected in cell wall and intercellular space of the parenchymatous tissue. The thickening of the cell wall via S- and G-lignin possibly prevents or limits the pathogen invasion into the plant and restricts the systemic diffusion of oxalic acid. This study showed the importance of cell wall modifications during interaction between B. napus and S. sclerotiorum. These results offer new insights into the host-pathogen-interaction and provide new breeding opportunities for resistance selection against S. sclerotiorum