Phosphorylation dependent stability control of the deneddylase DenA and its impact on Aspergillus nidulans development

Zusammenfassung Ein fehlerhafter Proteinabbau führt in höheren Eukaryoten zu diversen Krankheiten wie z.B. neurodegenerativen Störungen und Krebs. Es ist daher bedeutend die Regulationsmechanismen des Proteinabbaus zu verstehen. Intrazelluläre Proteine werden spezifisch durch das Ubiquitin-Proteasome System abgebaut. Cullin-RING Ligasen, welche durch das ubiquitin-ähnliche Protein Nedd8 aktiviert werden, binden und markieren das Zielprotein mit Ubiquitin. Diese ubiquitinierten Proteine werden durch das 26S Proteasome abgebaut. Die zwei Deneddylasen DenA und COP9 Signalosome (CSN) entfernen Nedd8 von unterschiedlichen Substraten. Diese Arbeit zeigt im Modellorganismus Aspergillus nidulans, dass DenA aus einer Kernfraktion sowie einer dynamischen zytoplasmatischen Subpopulation besteht. Zudem wird (A) das Zusammenspiel zwischen DenA und CSN im Kern untersucht und (B) die bisher unbekannte Phosphatase DipA, welche an der Regulation des zytoplasmatischen DenA und an der Zelldifferenzierung beteiligt ist, charakterisiert. (A) Eine erhöhte DenA Konzentration kann teilweise das Fehlen eines aktiven CSN kompensieren, indem es der Akkumulation an neddylierten Proteinen und damit CSN assoziierten Entwicklungsstörungen entgegenwirkt. Beide pilzlichen Deneddylasen haben somit unterschiedliche aber auch überlappende Funktionen. Zusätzlich zeigt sich, dass die DenA Kernfraktion, welche mit dem CSN interagiert, in der pilzlichen Entwicklung durch fünf benachbarte CSN Untereinheiten destabilisiert wird. Da diese Untereinheiten eine funktionelle Oberfläche bilden ist anzunehmen, dass die Interaktion von DenA mit dieser Oberfläche wichtig für die Stabilitätskontrolle der DenA Kernsubpopulation ist. (B) Zytoplasmatisches DenA wird zusammen mit DipA transportiert und akkumuliert an den Septen. Fehlt DipA erhöht sich die DenA Stabilität. Somit spielt DipA eine wichtige Rolle in der zytoplasmatischen DenA Stabilitätskontrolle. Zusätzlich führt das Fehlen von DipA zu einer erhöhten Septenbildung und Defekten in der lichtabhängigen Zellentwicklung des Pilzes. DipA wird somit, neben der DenA Stabilitätskontrolle, für die Zelldifferenzierung benötigt. Die Stabilität der zwei DenA Subpopulationen wird zusätzlich durch Phosphorylierung reguliert. Während vegetativen Bedingungen wird DenA durch die Phosphorylierung von S243 und S245 stabilisiert, was für die Initiierung der nachfolgenden asexuellen Entwicklung wichtig ist. Anschließend wird DenA durch eine Änderung des Phosphorylierungsmusters destabilisiert und abgebaut. Zusammenfassend zeigt diese Studie Einblicke in komplexe Mechanismen des DenA Proteinabbaus, welche womöglich auch in höheren Eukaryoten relevant sind.Summary Malfunctioning protein degradation in higher eukaryotes is associated with numerous diseases, including neurodegenerative disorders and cancer. Understanding regulation mechanisms of protein degradation is thus of particular importance. The ubiquitin- proteasome system selectively degrades intracellular proteins. Cullin-RING ligases, activated by the ubiquitin-like protein Nedd8, recognize target proteins and mediate the transfer of ubiquitin onto the protein. Ubiquitinated proteins are recognized and degraded by the 26S proteasome. The two deneddylases DenA and COP9 signalosome (CSN) remove Nedd8 from different kinds of substrates. For the model organism Aspergillus nidulans, this study reveals that cellular DenA consists of a nuclear and a dynamic cytoplasmatic subpopulation. This study further provides (A) detailed information on the interplay between nuclear DenA and CSN, and (B) uncovers a hitherto uncharacterized phosphatase, DipA, which plays an important role in regulating cytoplasmatic DenA, as well as cell development. (A) An increased amount of DenA partially compensates the lack of a functional CSN. DenA counteracts the accumulation of neddylated proteins and CSN associated developmental defects. This suggests that both fungal deneddylases have different but also overlapping functions. Further, nuclear DenA physically interacts with CSN and is destabilized during fungal development by five of the eight CSN subunits. These subunits form a functional surface on the CSN, and interaction of DenA with this surface seems an important step in regulating the stability of nuclear DenA. (B) Cytoplasmatic DenA is co-transported with DipA and enriched at septa. Deletion of dipA results in increased DenA stability. This suggests that DipA destabilizes DenA and thus plays a role in cytoplasmatic DenA stability control. In addition, deletion of dipA impacts cell development, which manifests itself in an increased amount of septa and defects in light regulated fungal development. This indicates that - beyond DenA stability control - DipA is important for cell differentiation. The stability of DenA is further regulated via phosphorylation. During vegetative growth, DenA is stabilized by phosphorylation at positions S243 and S245, which is required for initiating subsequent asexual development. After this initiation a change in the phosphorylation pattern of DenA is observed, which destabilizes the protein and results in DenA degradation in later asexual development. In summary, this study provides insights into complex mechanisms of DenA protein degradation, which might also be relevant for higher eukaryotes.