Anthelmintic niclosamide inhibits colorectal cancer cell lines via modulation of the canonical and non-canonical Wnt signalling pathway

Die Wnt/ β-Catenin-Signaltransduktion nimmt eine exponierte Stellung in der kolorektalen Karzinogenere ein. Niclosamid ist ein Derivat der Salicylsäure, das bei Bandwurm- infektionen eingesetzt wird. Es konnte gezeigt werden, dass Niclosamid den Wnt/ β-Catenin-Signalweg moduliert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den therapeutischen Einsatz des Niclosamids beim kolorektalen Karzinom zu evaluieren. Die Zellproliferation von kolorektalen Karzinomzelllinien (humane SW480 und SW620 Zellen sowie CC531 Zellen einer Ratte) und von Rattenfibroblasten wurde nach 12 und 24 Stunden Inkubation mit Niclosamid durch lichtmikroskopische Zellzahlbestimmungen beurteilt. Die Apoptoseraten wurden mit einem Zelltod-Assay ermittelt. Eine Immunfluoreszenzfärbung gab Aufschluss über das Expressionsmuster von aktivem β-Catenin. Die Promotoraktivität des LEF/ TCF-Transkriptionsfaktors wurde nach Transfektion mit TOPflash mithilfe eines Luciferase Assays analysiert. Die Genexpression von Wnt-modulierenden Faktoren (Bcl-9 und Wif1), von Komponenten des ß-Catenin- Degradationskomplexes (Axin2 und GSK 3β), von kanonischen Zielgenen (Met, MMP7 und Cyclin D1) und von c-jun als Schlüsselprotein des nicht-kanonischen Wnt/ JNK-Signalweges wurde in der RT-PCR untersucht. Auf Proteinebene wurden zur Bestätigung zusätzlich Western Blots mit Antikörpern gegen aktives β-Catenin und c-jun durchgeführt. Die Zellproliferation kolorektaler Karzinomzelllinien wurde dosisabhängig inhibiert, und Niclosamid führte zu Apoptose. Nach Inkubation mit Niclosamid kam es nicht zur Umverteilung von aktivem β-Catenin von der nukleären in die zytosolische Fraktion. Die Wnt-Promotor-Aktivität von LEF/ TCF wurde nach 12 Stunden Inkubation mit 10 und 50 μM Niclosamid jedoch signifikant gesenkt. Kanonische Wnt-Zielgene (Met, MMP7 und Cyclin D1) sowie der Koaktivator Bcl-9 wurden auf Transkriptionsebene gehemmt, während das nicht-kanonische Schlüsselprotein c-jun aktiviert wurde. Fasst man zusammen, so führt die Inkubation mit Niclosamid zu inhibitorischen Effekten auf kolorektale Karzinomzelllinien und zu einer reduzierten kanonischen Wnt-Aktivität. Diese Effekte können durch eine gestörte Formation des Triple-Komplexes aus Bcl-9, β- Catenin und LEF/ TCF und einer Aktivierung von c-jun und damit des nicht-kanonischen Wnt/ JNK-Signalweges bedingt sein. In in vivo-Untersuchungen beabsichtigen wir, in einem Tiermodell die Daten zu verifizieren und so den Einsatz des Niclosamids als Option für Patienten mit metastasiertem kolorektalem Karzinom weiterführend zu beurteilen.Wnt/ β-catenin-signalling is known to play an important role in colorectal cancer. Niclosamide, a salicylamide derivative used for the treatment of tapeworm infections, targets the Wnt/ β-catenin-pathway. The objective of this study was to investigate niclosamide as a therapeutic drug for colorectal cancer. Direct cell count determined the effects of niclosamide on cell proliferation of human (SW480 and SW620) and rodent (CC531) colorectal cancer cell lines as well as rodent fibroblasts following 12 and 24 hours of incubation. Cell death assay was used to detect apoptosis. Immunofluorescence staining demonstrated the expression pattern of active β- catenin. The promoter activity of the LEF/ TCF-transcription factor was analysed by luciferase assay after transfection of TOPflash. Gene expression of Wnt-modulating factors (Bcl-9 and Wif1), destruction complex interacts (axin2 and GSK3β), target genes (met, MMP7 and cyclin D1) and c-jun as the key player of the non-canonical Wnt/ JNK-pathway were analysed by RT-PCR. Western blot analysis was performed with antibodies detecting active β-catenin and c-jun. Cell proliferation in colorectal cancer cell lines was blocked dose-dependently and apoptosis contributed to niclosamide’s inhibitory potency. Following treatment on CC531, there was no shifting of active β-catenin protein from the nuclear to cytosolic pool. However, the Wnt promoter activity of LEF/ TCF significantly decreased with niclosamide at 10 und 50 μM after 12 hours of incubation. Canonical target genes (met, MMP7 and cyclin D1) as well as the co-activator Bcl-9 were down-regulated on the transcriptional level, whereas the non-canonical key player c-jun was clearly activated. Therefore, Niclosamide treatment was associated with inhibitory effects on colorectal cancer and reduced Wnt activity. It may exert its effects by interfering with the nuclear β- catenin-Bcl-9-LEF/ TCF triple-complex and by up-regulation of c-jun representing the non- canonical Wnt/ JNK-signalling. Thus, our findings warrant further research of this drug as a treatment option for patients with advanced-stage colorectal cancer.2016-02-1