Molecular role of Pelota (PELO) in differentiation of embryonic and germ stem cells

Pelo ist ein evolutionär konserviertes Gen, das in diversen Spezies charakterisiert wurde. In der Maus führt der Verlust von Pelo zu embryonaler Letalität in frühen Postimplantationsstadien. In vitro Studien mit Pelo-null Blastocysten haben gezeigt, dass PELO möglicherweise eine Rolle bei der Regulation des Zellzyklus oder der Selbsterneuerung der pluripotenten Embryonaler Stammzellen (Embryonic Stem Cells, ESCs) spielt. In der vorliegenden Arbeit sollte die molekulare Rolle von PELO bei der Selbsterneuerung und bei der Differenzierung von ESCs und Keimbahnstammzellen mit Hilfe eines konditionalen Pelo Knockout-Mausmodels in Kombination mit in vitro sowie in vivo Experimenten untersucht werden. Im ersten Teil der Arbeit konnten wir zeigen, dass PELO für die Selbsterneuerung von ESCs oder deren Differenzierung in die drei Keimblätter nicht notwendig ist, jedoch unabdingbar ist für die Differenzierung des extraembryonalen Endoderms (ExEn). Im Umkehrschluss wird durch die Überexpression von Pelo in ESCs das Programm zur Differenzierung des ExEn`s aktiviert. Auf molekularer Ebene konnten wir zeigen, dass die beeinträchtigte Differenzierung des ExEn`s in Pelo-defizienten Embryoidkörpern (Embryonic Bodies, EBs) aus einer reduzierten Aktivität des Bone Morphogenetic Proteins (BMP) resultiert. Dieses Ergebnis wurde durch weitere Experimente bestätigt, die gezeigt haben, dass Pelo-defiziente Zellen durch Behandlung mit BMP4 in das ExEn differenzieren können. In vivo Studien haben gezeigt, dass Pelo-null Embryonen am Tag 6.5 (E6.5) das ExEn besitzen, jedoch an E7.5 versterben. Dies lässt vermuten, dass PELO nicht für die Induktion der Entwicklung des ExEn`s notwendig ist, sondern vielmehr für dessen Erhaltung oder abschließende Differenzierung in das funktionelle viszerale Endoderm, das den Embryo mit Wachstumsfaktoren für die weitere Entwicklung versorgt. Zudem ist PELO notwendig für die BMP-Aktivierung zu Beginn der somatischen Zellreprogrammierung. Der Verlust von PELO beeinträchtigt die Reprogrammierung zur induzierten Pluripotenz. Außerdem konnten wir die konservierte Funktion von PELO im Qualitätskontrollmechanismus der RNA in murinen ESCs feststellen. Im zweiten Teil der Arbeit haben wir demonstriert, dass die Pelo-Expression essentiell für die Erhaltung der männlichen Fertilität und Spermatogenese ist. Der Verlust von Pelo während der Entwicklung von männlichen Keimzellen in Mäusen hat gezeigt, dass PELO für die Selbsterneuerung und Erhaltung der Spermatogonialen Stammzellen (Spermatogonial Stem Cells, SSCs) notwendig ist, jedoch für die Entwicklung der späteren Spermatogenesestadien sowie die Spermienfunktion erlässlich ist. Insgesamt zeigen unsere Studien die molekulare Rolle(n) von PELO in der frühen Embryonalentwicklung der Maus und bei der männlichen Fertilität auf. Unsere Ergebnisse geben Hinweise auf Ursachen von Defekten, die mit dem PELO Verlust zusammenhängen.Pelota (Pelo) is an evolutionary conserved gene, which has been characterized in diverse species. In mouse, Pelo deficiency results in embryonic lethality at early post-implantation stage. The in vitro culture of Pelo-null blastocysts revealed that PELO may have a role in the regulation of the cell cycle or self-renewal of embryonic stem cells (ESCs). The overall aim of the present study was to investigate the molecular role of PELO in self-renewal and differentiation of ESCs and germ stem cells by employing conditional Pelo knockout mouse model in combination with both in vitro and in vivo experiments. In the first part of the study, we found that PELO is dispensable for the self-renewal of ESCs or their differentiation potential to form three germ layers in the teratoma assays, but required for differentiation of extraembryonic endoderm (ExEn). Conversely, overexpression of Pelo in ESCs activates the differentiation program towards ExEn cell lineage. At the molecular level, we identified that the impaired differentiation of ExEn in Pelo-deficient embryoid bodies (EBs) is a result of decreased activity of bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway. This finding was further corroborated by experiments showing that Pelo-deficient cells could differentiate into ExEn in response to BMP4 treatment. In vivo studies showed the presence of ExEn in Pelo-null embryos at E6.5, yet embryonic lethality at E7.5, suggesting that PELO is not required for the induction of ExEn development, but rather for ExEn maintenance or for terminal differentiation towards functional visceral endoderm which provides the embryos with growth factors required for further development. In addition, we found that PELO is required for activation of BMP signaling during the initiation stage of somatic cell reprogramming and its loss impairs the reprogramming towards induced pluripotency. Furthermore, we observed the conserved function of PELO in RNA quality control mechanism in murine ESCs. In the second part, we demonstrate that the expression of Pelo is essential for the maintenance of male fertility and spermatogenesis. The consequences of Pelo deficiency on the development of male germ cells in mice showed that PELO is required for spermatogonial stem cells (SSCs) self-renewal and their maintenance, but is dispensable for the development of later stages of spermatogenesis and sperm function. Taken together, our studies uncovered the molecular role(s) of mammalian PELO in early embryonic development and in male fertility, and identified molecular pathways that are responsible for the defects resulting from Pelo depletion