Mechanisms of action of glucocorticoids in the mouse model of EAE - effect on effector and bystander T-cells and relevance of T-cell apoptosis

In der vorliegenden Arbeit wurden die grundlegenden Mechanismen der Glukokortikoidtherapie bei der MS anhand des Tiermodells der MS, der EAE, untersucht. Hierzu wurde die EAE aktiv mithil-fe von MOG35-55 in C57Bl/6-Mäusen sowie GRdim- und lckGRdim-Mäusen induziert. Zum einen sollte die Wirkung von Dexamethason auf Bystander- und Effektor-T-Zellen gesondert voneinander betrachtet werden. Hierzu sollte zunächst ein Modell etabliert werden, bei dem die GCs nur auf die Bystander- beziehungsweise nur auf die Effektor-T-Zellen wirkten. Trotz zahlrei-cher Experimente konnte kein Modell etabliert werden, dass den Ansprüchen für die Beantwor-tung der Frage genügte. Zum anderen wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass lckGRdim-Mäuse trotz fehlender Dimerisierungs-fähigkeit des GRs und somit fehlender Apoptose-Induktion in T-Zellen auf die GC-Therapie ebenso gut ansprachen wie Kontrolltiere. Ebenso konnte dies bei reinen GRdim-Tieren beobachtet werden. Zunächst wurde mithilfe von Zellzählungen, FACS-Analysen nach Anfärben der Splenozyten mit AxV und einem Apoptose-Assay ausgeschlossen, dass es in den Tieren mit dem veränderten GR doch zu einer Induktion von Apoptose kam. So konnte bestätigt werden, dass Apoptose nicht es-sentiell für die Therapie der EAE ist. Anhand eines Proliferations-Assays konnte ebenso ausgeschlossen werden, dass GCs unspezifisch die gesamte Funktionalität der Zellen beeinflussen. Im Folgenden wurden weitere mögliche Me-chanismen der Wirkung von GCs in der EAE untersucht. Anhand von FACS-Analysen und qPCR sowie histologischen Untersuchungen konnte gezeigt wer-den, dass die eingeschränkte Migration der Zellen in das RM nach Dex-Gabe eine wichtige Rolle zu spielen scheint. So sahen wir eine Herunterregulierung von Adhäsionsmolekülen sowie die ver-minderte Expression von einigen Zytokinen. Im Falle der Chemokine, die jedoch nur als Neben-schauplatz in dieser Arbeit betrachtet werden, konnte keine Herunterregulierung von RANTES in GRdim-Tieren beobachtet werden. Andere Publikationen geben jedoch Hinweise darauf, dass auch die Beeinflussung der Chemokine entscheidend am Mechanismus der GC-Therapie beteiligt ist. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass Transaktivierungsprozesse, im Speziellen die Induktion von Apoptose, keinen entscheidenden therapeutischen Effekt von Dex darstellen. Der tatsächliche Mechanismus konnte auch im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt wer-den. Durch die Versuche an GRdim-Tieren gibt es jedoch entscheidende Hinweise darauf, dass vor allem repressive Effekte als Wirkungsmechanismus der Kortisontherapie entscheidend sind. Hierzu zählen zum Beispiel die verminderte Expression von Adhäsionsmoleküle sowie die verminderte Ausschüttung von Zytokinen bzw. Sekretion von Chemokinen. Zusammengenommen also Prozes-se, die die Migration von T-Zellen ins ZNS beeinflussen und steuern. Dieser Aspekt hat eine große Bedeutung für die Therapie der MS, da gerade die Gene, die durch Transaktivierung induziert werden, zu den unerwünschten Nebenwirkungen der Therapie führen. Da diese keine Bedeutung in der Wirksamkeit der GC-Therapie zu haben scheinen, könnten Medi-kamente entwickelt werden, die selektiv die Gene, die durch Transrepression aktiviert werden, ansteuern. Dies würde ein großes Benefit für MS-Patienten nach sich ziehen, die im Rahmen der notwendigen Therapie ihrer Erkrankung mit teilweise gravierenden Nebenwirkungen zu kämpfen haben.In the present study, mechanisms of glucocorticoid (GC) therapy were investigated using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of multiple sclerosis. For this purpose, active EAE was induced in C57BL/6 mice and in mice with a point mutation in the glucocorticoid receptor (GRdim and lckGRdim mice) by immunization with MOG35-55. First, we wanted to examine the effect of dexamethasone (Dex) on bystander and effector T cells. For this, a model should be established in which GCs are able to act only on bystander or effector T cells. Despite numerous experiments, no model could be established that was suitable to address this question. Second, it was analyzed whether mice which carry a point mutation in the GR and are therefore defective in GR dimerization and apoptosis induction are still able to respond to GC therapy. Unexpectedly, mice harboring this point mutation ubiquitously (GRdim mice) or specifically in T cells (lckGRdim mice) were both fully responsive to GC therapy. Using cell counting and FACS analysis we excluded that induction of T cell apoptosis occurred in animals with the modified GR. Thus, GC-induced apoptosis is not essential for the treatment of EAE. In search for other mechanisms underlying the therapeutic effects of GCs, FACS analysis, qPCR and histological studies were performed which showed that reduced cellular migration into the central nervous system seemed to be an important mechanism of Dex therapy in EAE. We observed down-regulation of adhesion molecules in T cells and a diminished expression of several cytokines. When analyzing chemokine expression, down-regulation of RANTES was not observed in GRdim mice. Other publications provide additional evidence that the influence on chemokines crucially contributes to the mechanism of GC therapy. In summary, this work shows that processes involving gene transactivation, in particular the induction of apoptosis, do not play a critical role for the therapeutic efficacy of Dex. Although the final mechanism could not be entirely clarified in this work, the experiments pointed towards T cell migration, which could be established as a crucial mechanism in further follow-up studies. The finding that the mechanism of transactivation is dispensable for GC action in EAE is of great importance for the treatment of MS because the genes that are induced by transactivation cause undesired side-effects of GC therapy. It might therefore be possible to develop drugs that selectively target genes that are modulated by transrepression and thus cause less side effects, which would entail a great benefit for MS patients.2015-11-2