Functional analysis of the MERS-coronavirus spike protein

Zehn Jahre nach dem Ausbruch des Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV, ist ein neues Betacoronavirus, das Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV, auf der arabischen Halbinsel entdeckt worden. Seine anhaltende Ausbreitung stellt eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Das Spike (S) Protein der Coronaviren vermittelt den viralen Eintritt in Wirtszellen und bestimmt wesentlich den viralen Tropismus und die virale Pathogenese. Das Verständnis der Determinanten des MERS-CoV Spike (MERS-S)-vermittelnden Eintritts in Zellen könnte daher wichtige Einblicke in die MERS-CoV-Biologie liefern und war somit das erste Ziel dieser Arbeit. Um den Eintritt in die Zelle zu ermöglichen, muss das Coronavirus S-Protein durch Wirtszellproteasen aktiviert werden, welche potentielle Ziele für die therapeutischen Intervention darstellen. Daher sollten im zweiten Ziel dieser Arbeit Proteasen identifiziert werden, die MERS-S aktivieren. Das S-Protein ist das Hauptangriffsziel neutralisierender Antikörper und experimentelle Systeme zur S-Analyse können für die Diagnostik eingesetzt werden. Das letzte Ziel dieser Arbeit war es daher, die MERS-CoV Seroprävalenz in Saudi Arabien zu ermitteln. Es wurde ein lentivirales Vektorensystem etabliert, welches die Analyse des MERS-S-getriebenen Zelleintritts ermöglicht. Mit Hilfe dieses Systems konnte gezeigt werden, dass MERS-S den Eintritt in ein breites Spektrum humaner Zelllinien, wie Lungen-, Nieren- und Darmzellen vermittelt, was mit der klinischen Manifestation von MERS einhergeht. Der Wirtszelleintritt war unabhängig von bereits beschriebenen Coronavirus Eintrittsrezeptoren, wurde jedoch durch die endosomale Cysteinprotease Cathepsin L und die Transmembranserinprotease TMPRSS2 gefördert. Im Gegensatz dazu war die Aktivität von Proprotein Konvertasen für den S-Protein-vermittelnden Eintritt entbehrlich. Schließlich zeigten Neutralisationstests, dass Seren von Patienten aus der östlichen Provinz Saudi Arabiens, die zwischen 2010-2011 und 2012 entnommen wurden, keine MERS-S-neutralisierenden Antikörper enthielten. Dies deutet darauf hin, dass MERS-CoV-Infektionen vor dem Ausbruch 2012 nur selten vorkamen. Die gewonnen Ergebnisse tragen wesentlich zum Verständnis des MERS-CoV-Eintritts in Zellen bei und liefern wichtige Informationen zur MERS-CoV-Epidemiologie. Weiterhin könnte die Beobachtung, dass der Protease-Inhibitor Camostat, der für den Einsatz im Menschen zugelassen ist (in Japan), TMPRSS2 blockiert und damit den MERS-CoV Eintritt inhibiert, helfen, Behandlungsstrategien für MERS-Patienten zu etablieren.Ten years after the outbreak of the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV, which caused the first pandemic of the 21st century, a novel betacoronavirus, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV, emerged in the Arabian Peninsula. Its ongoing spread poses a significant threat to public health. The spike (S) protein of coronaviruses mediates viral entry into target cells and is a key determinant of viral tropism and pathogenesis. Understanding the parameters governing MERS-CoV spike (MERS-S)-driven entry might thus yield valuable information on MERS-CoV biology and was the first goal of the present study. In order to facilitate host cell entry, coronavirus S proteins depend on activation by host cell proteases, which are potential targets for therapeutic intervention. Therefore, the second goal of the present thesis was to identify the proteases responsible for MERS-S activation. The coronavirus S protein is the major target for the neutralizing antibody response and experimental systems for MERS-S can be used as diagnostic tools. The final goal of this thesis was thus to investigate the MERS-CoV seroprevalence in Saudi Arabian individuals. A lentiviral vector system was established that allows the analysis of MERS-S-driven host cell entry. With the help of this system, MERS-S was found to mediate entry into a broad spectrum of human cell lines, including cells from lung, kidney and colon which is in concordance with the clinical picture of MERS. Host cell entry was independent of previously described coronavirus entry receptors but was promoted by the endosomal cysteine protease cathepsin L and the transmembrane serine protease TMPRSS2. In contrast, the activity of proprotein convertases was dispensable for MERS-S protein-driven entry. Finally, neutralization of S protein-mediated entry revealed that neutralizing antibodies were absent in sera from patients of the Eastern Province of Saudi Arabia taken between 2010-2011 and 2012, indicating that MERS-CoV infections were rare events before the MERS outbreak in 2012. Collectively, these results provide important insights into the processes governing MERS-CoV entry and shed light onto MERS epidemiology. Furthermore, the demonstration that the protease inhibitor camostat, which is approved for use in humans in Japan, blocks MERS-CoV entry by inhibiting TMPRSS2, might help to establish treatment options for MERS patients