Analysis of the role of herbal agents and histone deacetylase inhibitors on growth factors and their signaling pathways in prostate cancer cells

Das Prostatakarzinom (PCa) ist die am häufigsten diagnostizierte Krebsneuerkrankung bei Männern in Deutschland sowie die dritthäufigste Ursache krebsbedingter Sterbefälle. Die Therapiemöglichkeiten für das PCa sind sehr beschränkt und mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden. Daher wurden in dieser Arbeit neue Therapieansätze verfolgt: zum einen wurde das Phytoöstrogen Tectorigenin (TG) und zum anderen der Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDI) Valproinsäure (VPA) auf die jeweilige Wirksamkeit gegen das PCa untersucht. Das Phytoöstrogen Tectorigenin wird aus dem Gesamtextrakt von Belamcanda chinensis-Rhizomen isoliert. Dieser Gesamtextrakt wurde zunächst in PCa-Zellen in vitro getestet. Sowohl in den humanen PCa-Zellen LNCaP als auch in den murinen PCa-Zellen 2E, die aus dem Prostatatumor einer Maus des TRAMP-(transgenic adenocarcinoma of mouse prostate) Mausmodells neu etabliert wurden, konnte eine Inhibition der Zellproliferation sowie eine Veränderung der Expression ausgewählter PCa-relevanter Gene detektiert werden. Anschließend wurde eine Microarray-Analyse durchgeführt, bei der einige differentiell exprimierte Gene nach der Behandlung der humanen LNCaP-Zellen mit Tectorigenin identifiziert werden konnten. Neben einer Reihe von Androgen-induzierten Genen traten u.a. der IGF-IR (insulin-like growth factor I receptor) und PSA (prostate specific antigen) auf. In vivo-Studien in TRAMP-Mäusen konnten zudem eine langsamere Progression des PCa nach Behandlung mit Tectorigenin zeigen. In den in vivo-Studien an subkutanen LNCaP-Tumoren im Nacktmaus-Modell konnte sowohl ein vermindertes Tumorgewicht als auch eine verminderte Tumorgröße nach der Behandlung der Mäuse mit Tectorigenin beobachtet werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Wirkung des HDI VPA auf PCa-Zellen untersucht. Funktionell konnte eine erhöhte Acetylierung des Histons 3 an Lysin 9 sowie eine Verringerung der Zellproliferation, -migration und -invasion nach der Behandlung der primären PCa-Zellen 2E mit VPA gezeigt werden. Molekular konnten einige differentielle Genexpressionen nach der Behandlung der 2E-Zellen mit VPA detektiert werden. Es konnte z.B. eine Abnahme der Androgenrezeptor-Expression, eine Zunahme der Expression des proapoptotischen Proteins Bim sowie eine Verringerung der Expression von Foxo1 und Gsk3β gezeigt werden. Weiterhin wurde eine Deregulation von Zellzyklus- und Angiogenese-relevanten Genen wie z.B. Cdkn1a, Cdk4, Vegfa und Hif1α beobachtet. Des Weiteren wurden Kandidatengene aus einer früheren Microarray-Analyse untersucht. Für alle sieben untersuchten Kandidatengene wurde die differentielle Genexpression nach der Behandlung der 2E-Zellen mit VPA sowohl konzentrations- als auch zeitabhängig mittels quantitativer real time PCR bestätigt. Für die verstärkt exprimierten Gene konnte ein Zusammenhang mit einer erhöhten Acetylierung des Promotorbereichs der jeweiligen Gene nach VPA-Behandlung dargestellt werden. Das Kandidatengen Cyclin D2 wurde für weiterführende Untersuchungen ausgewählt. Als einziges Mitglied der D-Typ-Cycline lag Cyclin D2 nach VPA-Behandlung verstärkt exprimiert vor. Diese Re-Expression konnte auch durch die Behandlung mit HDIs verschiedener Wirkstoffklassen hervorgerufen werden. Die Untersuchung der PCa-Zelllinien PC-3, DU145 und LNCaP nach VPA-Behandlung zeigte ebenfalls, wie bei den primären PCa-Zellen 2E, eine Re-Expression von Cyclin D2 sowie eine Inhibition der Proliferation. Nicht-maligne Zelllinien, die bereits eine hohe Basalexpression von Cyclin D2 aufweisen, veränderten durch VPA die Cyclin D2-Expression nicht und auch der Effekt auf die Zellproliferation war nur moderat vorhanden. Die Verringerung der Cyclin D2-Expression mittels siRNA in den murinen Fibroblastenzellen NIH/3T3 führte zu einem Anstieg der Zellproliferation. Dass Cyclin D2 im PCa einen Tumorsuppresor darstellt, zeigt auch die immunhistochemische Analyse von humanen PCa-Gewebeschnitten, bei der keine Expression von Cyclin D2 im PCa-Gewebe nachgewiesen werden konnte. In gesundem Prostatagewebe hingegen wurde Cyclin D2 in den proliferierenden Zellen exprimiert. Im Gegensatz dazu wurde Cyclin D1 im PCa-Gewebe stärker exprimiert als im gesunden Prostatagewebe. Schließlich wurden in vivo-Studien an TRAMP-Mäusen mit VPA-Gabe über das Trinkwasser durchgeführt. Es wurden drei verschiedene Versuchsgruppen untersucht. In der Überlebensstudie, welche VPA präventiv ab einem Alter von sechs Wochen erhielt, konnte ein höheres Überlebensalter, ein geringerer Tumoranteil sowie ein geringeres Tumorgewicht verzeichnet werden. Nach präventiver Gabe von VPA ab einem Alter von sechs Wochen bis zu einem Alter von 30 Wochen konnte kein Unterschied zwischen der VPA- und der Kontrollgruppe detektiert werden. In der Überlebensstudie nach therapeutischer Gabe von VPA ab einem Alter von 16 Wochen konnte ein höheres Überlebensalter und ein geringerer Tumoranteil, jedoch kein Unterschied im Tumorgewicht gezeigt werden.Prostate cancer (PCa) is the most frequently new diagnosed cancer entity and the third leading cause of cancer-related deaths of men in Germany. The options for therapy of PCa are restricted and most of them have strong side-effects. Therefore, new strategies for the therapy of PCa have been followed up in this thesis: the phytoestrogen tectorigenin as well as the histone deacetylase inhibitor valproic acid (VPA) have been investigated for their efficiency against PCa. The phytoestrogen tectorigenin is isolated from the full extract of the rhizome of Belamcanda chinensis. At first, this full extract has been tested in vitro. Both in the human PCa cell line LNCaP and the murine PCa cell line 2E, which was derived from the prostate tumour of a TRAMP-(transgenic adenocarcinoma of mouse prostate) mouse, cell proliferation was diminished and the expression of PCa-related genes was changed after the treatment. Subsequently, a microarray analysis was performed after the treatment of the human LNCaP cells with tectorigenin and several genes were detected as differentially expressed. Besides from a couple of androgen-inducible genes, the differential expression of the IGF-IR (insulin-like growth factor I receptor) and PSA (prostate specific antigen) were detected. In vivo studies in TRAMP-mice revealed a decelerated progression of the PCa after the treatment with tectorigenin. In in vivo studies on subcutaneously injected LNCaP-tumours in nude mice, a diminished tumour volume as well as a reduced tumour weight was monitored after the treatment with tectorigenin. In the second part of this thesis, the effect of VPA on PCa cells was investigated. Functionally, a higher acetylation of histone 3 at lysine 9 as well as diminished cell proliferation, invasion and migration was shown in the primary PCa cells 2E after the treatment with VPA. On the molecular level, several differentially expressed genes were detected after VPA treatment of 2E cells, e.g. a decreased androgen receptor expression, an increase in expression of the proapototic protein Bim as well as a diminished expression of Foxo1 and Gsk3β. Additionally, a deregulation of important factors for cell cycle progression and angiogenesis was shown, for example for Cdkn1a, Cdk4, Vegfa und Hif1α. Furthermore, candidate genes of a former microarray analysis were included in the examinations. For all seven candidate genes the differential expression was confirmed in a time and dose-dependent manner using quantitative real time PCR after the treatment of 2E-PCa cells with VPA. For the genes with an increased expression, a connection to increased acetylation in the promoter region after the treatment of 2E cells with VPA could be confirmed. The candidate gene cyclin D2 was chosen for further analyses. Cyclin D2 was the only member of the D-type cyclins that showed an increased expression after the treatment with VPA. This re-expression was also induced by histone deacetylase inhibitors of different classes. The analysis of other PCa cell lines (PC-3, DU145 and LNCaP) also showed, comparable to the effects in PCa cells 2E, an increase in cyclin D2 expression and an inhibition of proliferation after the treatment with VPA. Non-malignant cell lines, which already express cyclin D2 at high levels, did not change their cyclin D2 expression after the treatment with VPA and the effect on proliferation was only moderate. The decrease of cyclin D2 expression via siRNA caused an increase in proliferation. The fact that cyclin D2 is a tumour suppressor in PCa was also confirmed by immunohistochemical analysis of human PCa tissue, i.e. it was shown that cyclin D2 is not expressed in PCa tissue, whereas in healthy tissue of the prostate cyclin D2 was expressed in proliferating cells. In contrast, cyclin D1 showed a stronger expression in PCa tissue compared to healthy tissue of the prostate. Finally, in vivo studies in TRAMP-mice were performed by feeding VPA through the drinking water. Three different groups were investigated: a) In the survival group, where the mice were fed with VPA from six weeks of age, an increased survival was observed. Additionally, fewer mice with a prostate tumour and a lower tumour weight were detected. b) The preventive administration of VPA from six weeks to the age of 30 weeks did not show any differences as compared to the control group. c) In the therapeutical survival group, where the mice were fed with VPA from the age of 16 weeks on, a higher age of survival and fewer mice with a prostate tumour were detected, the tumour weight was comparable to control-treated mice