The role of the STAT1 linker domain in interferon signaling

STAT1 (Signaltransduktor und Aktivator der Transkription 1) gehört zu einer evolutionär hochkonservierten Proteinfamilie, die eine essentielle Rolle bei der Weiterleitung von Zytokinsignalen spielt. Das STAT1-Protein ist bei zahlreichen biologischen Prozessen, wie etwa der Zellproliferation oder der Steuerung der Immunantwort, von Bedeutung und gehört zu einer der am besten untersuchten humanen Trans-kriptionsfaktoren. Bekannt ist, dass die über STAT1 vermittelte Signaltransduktion durch eine Rezeptor-assoziierte Phosphorylierung eines kritischen Tyrosinrestes im carboxyterminalen Molekülbereich von STAT1 initiiert wird. Nach der Ausbildung von transkriptionell aktiven Dimeren translozieren diese in den Zellkern und binden auf den Promotoren von Interferon-gesteuerten Zielgenen. In dieser Arbeit wurden Punktmutanten in der Linker-Domäne des STAT1-Moleküls generiert, um die Bedeutung der reziproken SH2-Phosphotyrosin-Interaktion bei der Bildung von tyrosinphosphorylierten Dimeren in funktioneller Hinsicht studieren zu können. Die Substitution eines kritischen Lysinrestes in Position 550 im STAT1-Protein zu Alanin oder Glutamat war mit einer im Vergleich zum Wildtyp-Molekül verminderten Tyrosinphosphorylierung und einer verkürzten nukleären Akkumulationsphase der mutierten Proteine nach Stimulation von transient exprimierenden Zellen mit Interferon-gamma (IFN-gamma) verbunden. Bei normaler Dissoziationskinetik von STAT1-spezifischen DNA-Sequenzen fanden sich für die K550-Mutanten erhöhte In-vitro- und In-vivo-Dephosphosphorylierungsraten und identifizierten diese damit als gegenüber dem Wildtyp-Protein bevorzugte Substrate der inaktivierenden TC45-Phosphtase. Die mutationsbedingte Destabilisierung in der Architektur der Linker-Domäne resultierte in einer supprimierten Aktivierung von IFN-gamma-gesteuerten Zielgenen, wobei die Signalamplitude von der Ladung der eingeführten Seitengruppe bestimmt wurde. Zusammenfassend zeigen diese Beobachtungen, dass der Linker-Domäne eine wichtige Bedeutung bei der Regulation der Tyrosindephosphorylierung zukommt und unterstreichen überdies deren Rolle bei dem vermuteten Austausch zwischen einer parallelen und antiparallelen Dimerkonformation, die für eine optimale Genexpression essentiell ist.Signal transducers and activators of transcription (STATs) constitute an evolutionary highly conserved protein family, which play distinct roles in cytokine signaling. The family member STAT1, probably one of the best-studied human transcription factors, is engaged in numerous biological processes, such as cell proliferation and control of immune responses. It is well known that signaling via STAT1 is initiated by receptor-associated JAK kinases, which phosphorylate a single tyrosine residue in the STAT1 carboxy-terminal domain. Consequently, tyrosine-phosphorylated STAT1 dimers translocate to the nucleus, where they bind to palindromic DNA sequences in the promoter regions of interferon-gamma (IFN-gamma) responsive genes, termed gamma-activated sites. In this thesis, I have generated point mutants in the linker domain of STAT1 in order to study in more detail the significance of reciprocal SH2-phosphotyrosine interactions for IFN-gamma-driven gene expression. Substitution of either alanine or glutamate for a critical lysine at position 550 significantly decreased the level of STAT1 tyrosine phosphorylation upon stimulation of cells with IFN-gamma. Furthermore, IFN-gamma-induced nuclear accumulation was shortened in the presence of the mutation as compared to the wild-type molecule. Despite normal dissociation kinetics from GAS sites, the two K550 mutants showed increased dephosphorylation rates when exposed in vitro to the recombinant STAT1-inactivating TC45 phosphatase. Interestingly, the two mutants demonstrated reduced transcriptional activity on both artificial reporter gene constructs and endogenous STAT1-mediated target genes. In summary, these data indicate the STAT1 linker domain is required for maintaining sufficient amounts of tyrosine-phosphorylated STAT1 by protecting transcriptionally active dimers from their premature enzymatic inactivation.2014-07-0