Examination of the effects of HDAC inhibitors on amyloid precursor protein (APP) levels in tumor cells

Das Amyloid-Vorläufer-Protein (APP) ist ein integrales Membranprotein, welches in neuronalen und nicht neuronalen Geweben des Menschen exprimiert wird. Neben seiner bekannten Relevanz in der Pathogenese der Alzheimer-Erkrankung nimmt es eine weitere physiologische Rolle ein: APP ist ein Wachstumsfaktor. Diese Funktion machen sich auch Karzinomzellen zunutze. APP wird in Kolon-, Pankreas- und weiteren Karzinomzelllinien überexprimiert. Durch den HDAC-Inhibitor Valproat kann die Proliferation von Tumorzellen verringert werden. Dabei führt die Behandlung der Zellen mit Valproat zu einer Hyperacetylierung des Histons H4 und damit verbunden auch zu einer erhöhten Konzentration des Chaperon GRP78. Dieses hemmt die APP-Reifung, indem es das unreife APP bindet. Die intrazelluläre APP-Konzentration sinkt und die extrazellulären wachstumsfördernden Spaltprodukte wie sAPPα werden vermindert sezerniert. In der Folge wird die Proliferation der Tumorzellen signifikant inhibiert. Die Identifikation neuer und potenter HDAC-Inhibitoren hat eine große Relevanz, um neue Therapiestrategien in der Krebstherapie zu ermöglichen und die Überlebenschancen von Tumorpatienten zu verbessern. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung der Histon-Deacetylase-Inhibitoren Apicidin, Scriptaid, Sirtinol sowie APHA-Compound 8 auf die Tumorzelllinien Sw480 (Kolonkarzinom) und BxPc3 (Pankreaskarzinom) getestet. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass alle vier getesteten HDAC-Inhibitoren die Proliferation der untersuchten Tumorzellen hemmen. Die getesteten Medikamente wirkten dabei ohne Ausnahme in geringeren Konzentrationen auf Sw480 und BxPc3 als Valproat. Apicidin, Scriptaid und Sirtinol inhibierten zudem die Reifung von APP. In der Western-Blot-Analyse zeigte sich, dass die Konzentration des Amyloid-Vorläufer-Proteins nach Zugabe der Medikamente sank. Die Immunfluoreszenz bestätigte, dass Apicidin die APP-Konzentration in Sw480-Zellen konzentrationsabhängig vermindert. Dieses Ergebnis stützt die These, dass der Wachstumsfaktor APP auch durch die getesteten HDAC-Inhibitoren gehemmt wird. Zudem konnte in der Western-Blot-Analyse der molekulare Mechanismus der Medikamente, welcher mit dem von Valproat identisch ist, verifiziert werden. Histon H4 zeigte sich erwartungsgemäß hyperacetyliert, GRP78 wurde hochreguliert und APLP2 als APP-homologes Protein blieb unverändert. Eine Ausnahme stellt der HDAC-Inhibitor APHA-Compound 8 dar. Dieser inhibierte zwar die Proliferation der Zellen und in der Western-Blot-Analyse konnte eine starke Hyperacetylierung von Histon H4 dargestellt werden. Dennoch konnte in der Western-Blot-Analyse weder eine Inhibition des reifen noch des unreifen APP nachgewiesen werden. Zusammenfassend zeigte sich, dass Apicidin und Scriptaid das Amyloid-Vorläufer-Protein in niedriger Dosierung inhibieren können. Somit könnten die Medikamente in Zukunft in der Therapie von APP-positiven Tumoren und besonders im Fall der getesteten Karzinome neue Behandlungsoptionen bieten und das Spektrum der Behandlung erweitern.The ß-amyloid precursor protein (APP) is an integral membrane protein, which is expressed in neuronal and non-neuronal human cells. In addition to its well-known relevance in the pathogenesis of Alzheimer’s disease, APP also plays a physiological role as growth factor. It has been shown that APP is overexpressed in cancers of colon and pancreas, which may contribute to growth acceleration in these tumors. Valproate is an Histone deacetylase inhibitor (HDAC inhibitor) that reduces intracellular APP concentration and proliferation of tumor cells via hyper acetylation of histone H4 followed by an increase in chaperone GRP78 that inhibits APP maturation by binding immature APP. The development of new potent HDAC inhibitors may be of great relevance to identify new therapeutic strategies in cancer therapy and improve survival of cancer patients. This study examines the effect of the HDAC inhibitors apicidin, scriptaid, sirtinol and APHA-Compound 8 in tumor cell lines Sw480 (colon carcinoma) and BxPC3 (pancreatic cancer). All four tested HDAC-inhibitors, particularly apicidin and scriptaid inhibit proliferation of tumor cells at lower concentration than valproate. Apicidin, scriptaid and sirtinol also inhibited the maturation of APP. Western blot analysis showed that the concentration of APP decreased. In addition, immunofluorescence confirmed that apicidin decreased APP concentration in SW480 cells. Histone H4 was hyperacetylated, GRP78 was upregulated. These results support the hypothesis that APP in cell lines of colon and pancreatic carcinoma are inhibited by HDAC inhibitors, particularly apicidin and scriptaid. In addition, Western blot analysis suggests that the molecular mechanism is identical to valproate. The drugs could offer new treatment options in the treatment of APP-positive tumors.2013-10-0