The role of phosphoinositides in auxin signaling in Arabidopsis thaliana

Auxin ist eines der wichtigsten Phytohormone für das pflanzliche Wachstum und die Entwicklung und ein entscheidender Regulator des Gravitropismus. Für alle auxinvermittelten Prozesse ist die spezifische Verteilung des Hormons innerhalb der Gewebe relevant. Diese wird durch spezialisierte Auxintransporter umgesetzt, von denen besonders die PIN-Auxinexporter entscheidend sind. PINs lokalisieren in einer Zelle in den meisten Fällen polar an einer Seite der Plasmamembran um einen strikten Auxinfluss in das Zielgewebe zu erzeugen. Diese PIN-Verteilung muss dynamisch sein, damit der Auxinfluss zum Beispiel im Falle gravitroper Stimulation zügig in ein anderes Gewebe umgeleitet werden kann. Die schnelle Umverteilung der PINs hängt unter anderem von der Zusammensetzung und Funktionalität der Plasmamembran ab. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass PIs eine wichtige Funktion bei der Vesikelbildung und der Rekrutierung der dafür nötigen Proteinmaschinerie einnehmen. In dieser Arbeit wurde getestet, ob PIs eine Rolle bei der PIN-Verteilung spielen. Pflanzen mit Störungen im PI-Syntheseweg wurden auf ihre gravitropen Krümmungseigenschaften und ihre PIN- und Auxinverteilung untersucht. Eine pip5k1 pip5k2-Doppelmutante zeigte neben verminderter gravitroper Krümmung auch eine gestörte PIN-Lokalisation als Defekt bei der Auxinverteilung, da sich Auxin mittels eines DR5::GUS-Reporters in der Wurzelspitze der Mutanten nicht nachweisen ließ. Diese Experimente lieferten daher wichtige Hinweise darauf, dass PtdIns(4,5)P2 eine Rolle bei der Lokalisierung und Umverteilung und damit der Regulierung des Auxinflusses spielen. PtdIns(4,5)P2 ist nicht nur als intaktes Lipid für viele Signalwege in der Pflanze relevant. Auch die abgeleiteten IPPs spielen eine wichtige Rolle. In der Kristallstruktur des Auxinrezeptors TIR1 wurde ein InsP6-Kofaktor beschrieben, dessen Funktion aber bisher unklar blieb. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ipk1-1-Mutanten und InsP 5-Ptase-Pflanzen mit verminderten Gehalten an InsP6 auf Auxin-vermittelte Prozesse wie gravitrope Krümmung und die Verteilung von Auxin und dessen Transporter untersucht. Weiterhin wurde die Transkription auxinabhängiger Gene getestet. Dazu wurden diese Pflanzenlinien gravitrop stimuliert und die Transkriptgehalte in der Wurzelspitze nach dieser Stimulation mittels einer Transkript-Arrayanalyse mit Pflanzen des Wildtyps verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass die gravitrope Stimulation in Wildtyppflanzen eine deutliche Veränderung der Genexpression hervorruft, die sich in ipk1-1-Mutanten und die InsP 5-Ptase-Pflanzen nicht beobachten ließ. Verifizierungen ausgewählter Gene mittels qPCR bestätigten die Befunde. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass sowohl PIs, als auch abgeleitete IPPs, im besonderen InsP6, eine Rolle bei auxinvermittelten Prozessen spielen.The influence of the phosphoinositide network on auxin-signaling in Arabidopsis thaliana The phytohormone auxin (IAA) is a key regulator of growth and organ formation as well as a signal for tropical responses in plants, including the model plant Arabidopsis thaliana. An IAA-gradient is established towards the basal sides of plant tissues that serves as a developmental cue or guides the direction of gravitropic bending responses. The polar distribution of IAA is mediated by auxin transport systems, especially PIN auxin efflux carriers, which localize intracellularly in a strictly polar pattern at one side of the plasma membrane of plant cells. It was a working hypothesis of this thesis that phosphoinositides (PIs), regulatory membrane phospholipids, contribute to the polar distribution of PIN-proteins and, thus, partake in auxin signaling. In previous experiments it has been established that PIs are required for plant gravitropic bending, but so far the mechanisms by which PIs or PI-derived signals interact with auxin signaling are not clear. The PI, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) has an important function for vesicle trafficking and in recruiting proteins which are crucial for cytosis processes at the plasma membrane. A. thaliana pip5k1 pip5k2 double mutants showed reduced gravitropic bending and disturbed PIN localization, accompanied by reduced auxin transport. These results show that PtdInsP(4,5)P2 has an important role for the polar distribution of PINs and auxin. In a second part of this thesis, it was hypothesized that not only the intact lipid, PtdInsP(4,5)P2 is important for auxin signaling in plants but also PtdInsP(4,5)P2-derived inositolpolyphosphates (IPPs). In previous studies the IPP inositolhexakisphosphate (InsP6) was found as a cofactor in the structure of the auxin receptor TIR1. To address whether InsP6 had functional relevance for auxin perception, auxin-dependent processes were studied in Arabidopsis wild type and in ipk1-1 mutants and transgenic InsP 5-Ptase plants with reduced levels of InsP6. As an example for auxin-dependent tropical growth the gravitropic response of hypocotyls and roots was monitored and both ipk1-1 mutants and InsP 5-Ptase plants exhibited substantially reduced gravitropic curvature for both organs. TIR1 is a part of the SCFTIR1-complex. Binding of auxin to TIR1 mediates proteasomal degradation of AUX/IAA transcriptional repressors, enabling auxin-induced gene expression. Because changes in auxin-induced gene expression represent a read-out for TIR1 function, the induction of gravity-induced genes was monitored in root tips using transcript arrays. The array data indicate that transcript levels of auxin-dependent genes induced by gravistimulation in wild type controls were mostly not changed or differently regulated in the ipk1-1 mutants and InsP 5-Ptase plants. The findings present evidence that InsP6 is a cofactor required for full TIR1 functionality in Arabidopsis. Overall, the data presented in this thesis establish PIs and PI-derived IPPs as integral aspects of auxin signaling in A. thaliana that control the distribution of auxin as well as its perception