Das Timing der endgültigen Formierung des SNARE Komplexes in der Exozytose

Der Informationstransfer zwischen individuellen Neuronen mittels Exozytose bedarf der Fusion sekretorischer Vesikel mit der Plasmamembran und benötigt die Komplexbildung der SNARE Proteine Syntaxin-1, SNAP-25 und Synaptobervin 2. Obwohl der SNARE Komplex in in-vitro Systemen gründlich charakterisiert wurde, ist bisher nur wenig über den molekularen Mechanismus der Reaktion in vivo bekannt. Vor allem ist ungeklärt, welche Rolle die SNARE Proteine in Schritten spielen, die zum Erlangen der Fusionskompetenz sekretorischer Vesikel notwendig sind („docking“, „priming“) und wie genau die Bildung des Komplexes Fusion ermöglicht. In dieser Arbeit wurde die Rolle der SNARE Proteine und deren Bindungspartner in „docking“, „priming“ und der Fusion der Vesikel untersucht. Als Modellsystem erlaubt die Chromaffinzelle die Analyse der Rolle der einzelnen Proteine in den verschiedenen Stadien des Fusionsprozesses in „knockout“ Mäusen. Eine Reihe verschiedener Methoden wurde angewandt; sowohl Elektronenmikroskopie als auch elektrophysiologische Messungen und biochemische Analyse erlaubten die Analyse der einzelnen Reaktionsschritte und die Etablierung eines Reaktionsmodells. Es wurde festgestellt, dass SNAP-25, zusammen mit den bereits bekannten „docking“ Faktoren Syntaxin und Munc-18 für die „docking“ Reaktion essentiell ist. Die Rolle von Munc-18 in diesem Prozess könnte in der Stabilisierung einer Syntaxin:SNAP-25 „docking“-Plattform liegen, die die stabile Assoziation der Vesikel an der Freisetzungsstelle erlaubt. Zusätzlich ist Munc-18 jedoch wichtig für die folgende „priming“ Reaktion. Synaptotagmin-1 wurde erstmalig als vesikulärer „docking“-Faktor charakterisiert. Um den molekularen Mechanismus der SNARE-Komplexbildung in der Exozytose exakt zu beschreiben, wurde eine Mutagenesestudie durchgeführt. Mit der Absicht, den Komplex regional zu schwächen, wurden Punktmutationen des vesikulären SNARE Proteins Synaptobrevin 2 generiert und mit Hilfe viraler Expressionssysteme in „knockout“ Zellen phenotypologisch untersucht. Eine deutliche Regiosensitivität wurde gefunden: N-terminale (Membran distale) Destabilisierung verlangsamte in erster Linie die „priming“ Reaktion, wohingegen C-terminale (Membran proximale) Destabilisierung die Geschwindigkeit der Sekretion reduzierte und zusätzlich die Lebensdauer der Fusionspore verkürzte. Die gefundene Regiosensitivität stimmt mit einem Model überein, demzufolge N-terminale SNARE Interaktion für „priming“ wichtig ist und C-terminale Bindung Exozytose „triggert“ und die Fusionspore stabilisiert. Alles in allem erlauben die Daten die erstmalige Entwicklung eines Models der verschiedenen Schritte der vesikulären Freisetzungsmaschinerie in Chromaffinzellen in Bezug auf „docking“, „priming“ und Fusion.Transfer of information between individual neurons via exocytosis is mediated by fusion of secretory vesicles with the plasma membrane and requires assembly of the SNARE proteins Syntaxin-1, SNAP-25 and Synaptobrevin 2 into a complex. Although the SNARE complex has been thoroughly studied in-vitro and many of its features including its structure have been characterized, little is known about the molecular mode of action in vivo. Above all, it remains to be established how action of the SNAREs mechanistically is involved in the steps necessary for synaptic vesicles to gain fusion competence (docking, priming) and how formation of the SNARE complex is involved in the final steps of fusion. The present studies investigated the role of the SNARE proteins and their binding partners in docking, priming and fusion of secretory vesicles. As a model system, the mouse chromaffin cell enables the analysis of the role of individual proteins at the different stages of the release cycle in the clean genetic background of knockout mice. A number of different methodological approaches, ranging from electron microscopy to electrophysiological characterization, or mere biophysical techniques were utilized in order to generate a model of vesicle maturation and the molecular players involved therein. It was found that SNAP-25 with the already known docking factors syntaxin and Munc-18 is essential for docking. Munc-18 may act by stabilizing a syntaxin:SNAP-25 docking platform required for stable association of the secretory vesicle to its release site, but its action is additionally crucial for subsequent priming. The vesicular docking factor was identified as synaptotagmin 1, also known as the prime Ca2+ sensor for triggered release. In order to further understand the exact molecular mechanism of SNARE complex assembly in the process of transmitter release, a mutagenesis approach was employed. Seeking to regionally weaken the SNARE complex, mutant variants of the vesicular SNARE protein Synaptobrevin 2 were introduced in knockout cells by viral overexpression and the secretory phenotype was characterized. A strong regio-sensitivity to SNARE destabilization with major effects of N-terminal (membrane distal) destabilization on pool size but without effects on release kinetics was found. In contrast, C-terminal (membrane proximal) destabilization had a profound effect on the speed of transmitter release and, in addition, reduced the lifetime of the fusion pore. The regio-sensitivity observed agrees with a model of sequential SNARE complex assembly, in which N-terminal binding is involved in vesicle priming and C-terminal binding is required for exocytosis triggering and fusion pore stability. Together, these data, for the first time, allow the building of a model at the different stages of the vesicular release machinery in chromaffin cells with regard to docking, priming and fusion