Navarro González, Mónica

Coprini sind eine Gruppe von Pilzen, die meist auf Kompost und Pferdemist wachsen und mehr als 100 Jahre in einer einzigen Gattung zusammengefasst waren. Erst im Jahr 2001 wurde von Redhead und Mitarbeitern entdeckt, dass die Gattung aus vier unterschiedlichen Gattungen: Coprinus, Coprinopsis, Coprinellus undParasola besteht. Einige Arten aus dieser Gattung, darunter der Modellorganismus für Basidiomyzeten Coprinopsis cinerea (früher Coprinus cinereus), wurden bereits zuvor zur Untersuchung der Fruchtkörperentwicklung verwendet, weil sie leicht im Labor anzuziehen sind und Fruchtkörper bilden. Somit überrascht, dass die Fruchtkörperentwicklung von C. cinerea bisher nicht vollständing in der Literatur beschrieben wurde. Eine Aufgabe dieser Arbeit war es deshalb einen Bildkatalog mit allen wichtigen Entwicklungsphasen bis zur Fruchtkörperreifung und Autolyse zu erstellen. Ein Merkmal für einige Pilze aus dieser Gattung ist die schnelle Zersetzung, weswegen die Fruchtkörper z.B. für medizinische Anwendung wenig attraktiv sind. Eine Literaturrecherche zu medizinischen und pharmazeutischen Inhaltsstoffen belegt jedoch das große Potential der Coprini für die Isolierung von pharmazeutisch relevanten Verbindungen. Weiterhin locken C. cinerea Kulturen Milben an. Nach einer unerwünschten Infektion von Pilzkulturen mit der Milbe Tyrophagus putrescentiae wurde die Gelegenheit genutzt, die Wechselwirkung zwischen diesen beiden Arten zu untersuchen. Die Milben ernährten sich sowohl von dem Myzel der Monokaryonten als auch von dem der Dikaryonten inklusive der asexuellen Sporen (Oidien), allerdings in unterschiedlichem Maße. Außerdem wurde auch Hutgewebe aus den Fruchtkörpern zusammen mit den Basidiosporen gefressen, der Stiel blieb unangetastet. Die Basidiosporen wurden zwar gefressen, allerdings nicht verdaut. Sie werden später mit dem Milbenkot ausgeschieden. Solche Sporen waren noch in der Lage zu keimen. Aus den circa 400 Sporen pro Milbenkotpellet wächst zunächst Myzel aller Kreuzungstypen, was eine Kreuzung direkt nach der Keimung ermöglicht. Das so entstehende Dikaryon kann wieder fruktifizieren. Die Dikaryonbildung zwischen Geschwistern fördert Inzucht bei einem Pilz, der normalerweise ein „Outbreeding“-Organismus ist. Auf diese Weise, können die Milben den Pilz beeinflussen. Der Pilz hingegen beinflusst die Milben dadurch, dass die Milbeneier neben dem Milbenkot abgelegt werden. Die Larven schlüpfen nach ungefähr fünf Tagen und ernähren sich von dem Myzel, das bereits aus dem Kot gekeimt ist. Fruchtkörperentwicklung unter Laborbedingungen ist nicht auf C. cinerea beschränkt. Auch bei Coprinopsis clastophylla und einer mit Coprinellus curtus verwandten Art wurde die Fruchtkörperentwicklung beobachtet. Diese Arten produzierten ungewöhnliche Formen, und die Fruchtkörper waren zum Teil unfruchtbar. Solche Fruchtkörperformen, sogenannte Anamorphe, produzieren besondere mitotische Zellen (Bulbillen, Lysomere, oder Sphärocysten) für die vegetative Vermehrung. ITS-Analysen zeigten, dass die in der Literatur als anamorph beschriebenen Stämme Rhacophyllus lilacinus zu der Gattung Coprinopsis und zu der Art C. clastophylla (Coprinus clastophyllus) gehören. Andere Stämme mit ungewöhnlichen Pilzformen wurden durch ITS-Analysen der Gattung Coprinellus, verwandt mit C. curtus, zugeordnet. Morphologisch sind Pilze dieser nicht identifizierten Art nicht von Pilzen, die der Beschreibungen von Coprinopsis stercorea entsprechen, zu unterscheiden. Orton und Watling (1979) beschrieben C. stercorea als heterothallisch. Unser Stamm ist jedoch homothallisch. Dieser Unterschied in den Kreuzungssystemen könnte gegensätztliche Berichte von homothallischen und heterothallischen Formen von C. stercorea in der Literatur erklären. Berichte aus der Literatur zeigen, dass C. clastophylla auf Holz wächst, was ein weiterer Grund war, sich in dieser Arbeit mit dieser Pilzart zu beschäftigen. Von anderen Coprini ist bekannt, dass sie auf Holz wachsen, allerdings gibt es zurzeit keine systematische Studie. Aus diesem Grund, wurde sämtliche verfügbare Literatur über Coprini auf Holz gesammelt und ausgewertet. So stellte sich heraus, dass ungefähr 30% der Arten aus den neuen Gattungen (Coprinus, Coprinopsis, Coprinellus und Parasola) auf Holz beobachtet wurden. Solche Beobachtungen deuten darauf hin, dass Coprini auf Holz gut wachsen können. Anzuchtversuche mit Coprinisammlungen auf lignocellulotischen Substraten (Pappel, Buche), Weizenstroh sowie Eichen- und Ahornblättern wurden durchgeführt. Die Identität dieser Arten wurde mittels ITS-Analysen ermittelt. So stellte sich heraus, dass einige Isolate zuvor falschen Copriniarten zugeordnet wurden, in einem Fall sogar der falschen Gattung. Das zeigt, wie schwierig es ist, aus morphologischen Merkmalen eine Art zu identifizieren. Einige der untersuchten Stämme gehörten zu den Arten Coprinus comatus, Coprinopsis strossmayeri, Coprinellus curtus, Coprinellus micaceus, Coprinellus radians, Coprinellus xanthothrix. Diese wuchsen auf Holz und Stroh, ebenso wie zwei unbekannte Coprinellus Arten. Allerdings scheint der Abbau von Lignocellulose nicht in nennenswertem Ausmaß zu erfolgen. Wahrscheinlich wachsen die Pilze auf Speicherstoffen aus den parenchymatischen Zellen von Holz und Stroh. Wachstum auf Blättern wurde selten beobachtet, vermutlich weil Phenole aus den Blättern das Pilzwachstum hemmen oder weil Blätter nicht genug leicht verfügbare Nährstoffe enthalten. Zusätzlich wurden die Stämme auf ihre Phenoloxidaseproduktion getestet, insbesondere auf die Laccaseproduktion. Die Stämme konnten diese Enzyme zumindest auf Stroh produzieren. Dennoch sind weitere Untersuchungen notwendig. Der Laccaseaktivität wurde schon früher eine wichtige Rolle bei der Fruchtkörperentwicklung zugeschrieben. Deshalb wurde die Laccaseaktivität und die Laccasegenexpression während der Fruchtkörperentwicklung von C. cinerea untersucht. Die Gentranskription und die enzymatische Aktivität waren in den letzten Phasen der Fruchtkörperentwicklung (Primordia, Karyogamy, Meiose und Basidiospore Bildung, und Reifung und Autolyse) am höchsten. Obwohl Laccasen mit Kupfer induziert wurden, war die Aktivität auf dem Medium sehr gering. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Enzyme eher eine Rolle bei der Entwicklung, z.B. bei der Pigmentenbildung, spielen als bei der Nährstoffnutzung. Kupferzugabe hatte starken Einfluss auf die Fruchtkörperentwicklung. Obwohl sonst bei 37°C keine Fruchtkörperbildung stattfindet, wurde diese durch Kupferzugabe induziert. Dies war verbunden mit erhöhter Nitratereduktase-Aktivität und gleichzeitig erhöhtem pH-Wert durch Ammoniumproduktion. Da keine Nitritreduktase-Aktivität nachgewiesen wurde, ist es unwahrscheinlich, dass die Ammoniumproduktion auf einer Kombination von Nitrat- und Nitritreduktase-Aktivität beruht.The coprini are a form group of mushrooms that grow mainly on compost and horse dung and that for over 100 years were thought to present one genus. Only in 2001 it was discovered by Redhead and coworkers by molecular analysis that the traditional genus comprises species of 4 different genera: Coprinus, Coprinopsis, Coprinellus and Parasola. Several species of the traditional genus, amongst the basidiomycete model species Coprinopsis cinerea (formerly Coprinus cinereus), found previously attention for mushroom development by the ease to grow and fruit the fungi in culture. Surprisingly therefore, not even the pathway of fruiting body development for the model species C. cinerea was well presented in all different developmental stages in the literature. A task in this study was therefore to establish a picture catalogue of the events in the course of fruiting body development, up to fruiting body maturation and subsequent rapid autolysis of the mushrooms, a feature that is specific for many species of the coprini. Due to this autolysis, mushroom of coprini have so far made little use of e.g. for medicinal purposes. A literature compilation in medical and pharmaceutical compounds shows however that coprini have a potential for such applications. C. cinerea mycelia cultures attract mites that graze on the mycelium of the fungus. Upon an unintended infection of a culture by mites of the species Tyrophagus putrescentiae, the chance was taken to observe the behavior of the two species with each other. The mites were found to consume, albeit at different rates, mycelium of monokaryons and dikaryons including asexual spores (oidia) in the aerial mycelia. Furthermore, the animals consume cap tissues of fruiting bodies together with basidiospores but they leave the stipes aside. Basidiospores are ingested but not digested. They are excreted in compact faecal pellets. Basidiospores can still germinate after passing the gut of the mites. Since there are about 400 spores in a faecal pellet, mycelia of all mating types will arise and upon germination directly mate giving rise to dikaryons able to fruit. Dikaryon formation between germinated siblings promotes inbreeding in a fungus that naturally is an outbreeding organism. Thus, mites clearly affect the fungal life cycle. In turn, the fungus also influences the mites. Eggs are laid by the mites next to the faecal spore pellets. When the larvae hatch after about 5 days, the germinated mycelium will have obtained already a considerable colony size, presenting food for the young mites. Fruiting body development in the laboratory is not restricted to C. cinerea. In this thesis, fruiting body development was also followed up in Coprinopsis clastophylla and a species related to Coprinellus curtus, initiated by the observation that these species form unusual shaped mushrooms. Sometimes the structures are fully sterile, not forming basidiospores. The obtained fruiting body like structures are considered as anamorphs producing special mitotic cells (bulbils, lysomeres, or spherocytes) for vegetative reproduction. Molecular analysis of ITS sequences confirm that the strains described in the literature as anamorph Rhacophyllus lilacinus belongs to the genus Coprinopsis and the species C. clastophylla (Coprinus clastophyllus). Other strains with unusual shaped mushrooms were assigned by ITS sequences to the genus Coprinellus to a species closely related to C. curtus. Morphologically, the mushrooms of this unidentified species are not distinguishable from mushroom descriptions of Coprinopsis stercorea. Orton and Watling (1979) described C. stercorea to be heterothallic. Our isolate however is homothallic. This difference in the breeding systems can explain contradictory reports on C. stercorea in earlier literature on occurrence of homothallism and heterothallism in the species. Another reason to study C. clastophylla in this thesis was because of reports on the fungus in the literature as growing on wood. Also other species of the coprini were said to grow on wood, but a systematic study so far was not available. Therefore, all available literature on coprini on wood was collected and analyzed. It was found that about 30% of species in the new genera (Coprinus, Coprinopsis, Coprinellus and Parasola) have been observed on wood, suggesting that the ability of the fungi to grow on wood was more extended amongst these fungi than formerly thought. Attempts were undertaken with collections o f coprini to grow the fungi on lignocellulosic material including wood (poplar, beech), wheat straw and oak and maple leave litter. Prior to the growth test, species identity was controlled by analysis of ITS sequences. It was found that several isolates were assigned to wrong coprini species, and in one case even to a wrong genus indicating the difficulty of morphological identification of coprini. Several of the tested strains identified to the species Coprinus comatus, Coprinopsis strossmayeri, Coprinellus curtus, Coprinellus micaceus, Coprinellus radians, Coprinellus xanthothrix, and 2 unidentified Coprinellus species, grow on wood and straw, but degradation of lignocellulose by these species appears not to be considerable. Probably, the fungi rather grow on the storage material present in the parenchymatic cells of the wood and straw. On leave litter, growth occurred only in exceptional cases, suggesting that phenolic compounds in the fallen leaves inhibit fungal growth and/or that the leaves do not contain easily accessible nutrients. To further get insight into the ability of the species to degrade lignocellulose, phenoloxidase activities and in particular laccase activities of the strains were tested. At least on straw, most strains had visible enzymatic activities. Participation of these enzymes in substrate degradation has to be studied further in the future. Laccase activity had also been connected in the past to fruiting body development. Therefore, laccase activity and laccase gene expression was followed up during growth and development in C. cinerea. Activity of gene transcription and enzymatic activity was highest in the later stages of fruiting body development (primordia, karyogamy, meiosis and basidiospore formation, and in maturation and autolysis of the fruiting bodies). Laccases were found to be induced by addition of copper in the medium but induction levels were relatively low. The result suggests that in this fungus laccases have rather developmental functions, such as in pigment formation, than functions in substrate utilization. Copper addition had further surprising effects on fruiting body development of the species. Fruiting was induced at the unusual temperature of 37°C together with nitrate reductase activity at a stage when the fungus actively increased the pH of the medium by ammonium production. Since nitrite reductase activity was not found, it is unlikely that ammonium secretion is due to combined actions of nitrate and nitrite reductases