Eine neue Phosphatase moduliert die Antwort auf DNA Schaden und der Tumor-Unterdrücker p53

Das Genom einer jeden Zelle ist dem ständigen Einfluss schädlicher endogener und exogener Faktoren ausgesetzt. Beschädigungen der DNA und DNA-Mismatch können zu Genom Instabilität führen, einer der Hauptursachen von Krebs. Die schnelle Erkennung und Reparatur beschädigter DNA, sowie die Ausschaltung von Zellen mit irreparablen Schäden sind daher essentiell für die Erhaltung von Genom Integrität und Unterdrückung von Entartung. Diese Prozesse hängen von einer Phosphorylierungskaskade die auch Antwort auf DNA-Schaden (DNA damage response) genannt wird. Die Phosphorylierung des Histon-Proteins H2Ax an Ser139 ist einer der ersten Schritte nach Aktivierung der Kaskade und das phosphorylierte Histon γH2Ax dient als Marker für Beschädigte Bereiche des Chromatins. Eine Reihe von Kinasen initiieren das Signal am Ort der DNA-Beschädigung und vermitteln die Aktivierung von Effektor-Proteinen wie dem Tumorsuppressor p53. Aktivierung von p53 induziert das Aussetzen des Zellzyklus durch erhöhte Transkription des Cdk-Inhibitors p21 und kann Apoptose durch Transkription proapoptotischer Gene einleiten. Das Verhältnis zwischen phosphorylierten und nicht phosphorylierten Proteinen reguliert fast alle der bekannten Schritte der Antwort auf DNA-Schaden. Es ist daher zu erwarten, dass Phosphatasen eine Rolle bei der Steuerung dieser Kaskade spielen, dennoch ist nur wenig über ihre genaue Rolle bekannt. Es wurde ein high-throughput Screen mit einer siRNA-Bibliothek gegen humane Phosphatasen durchgeführt um neue Phosphatasen, die in die Antwort auf genotoxischen Stress involviert sind, zu identifizieren. Mit siRNA transfizierte U2OS Zellen, aus Osteosarkom abgeleitet mit wildtyp p53, wurden UVC Strahlung ausgesetzt um DNA-Beschädigungen hervorzurufen. Die Level von p53 und γH2Ax wurden in Zellen mit und ohne vorheriger UVC Exposition durch Imunofluoreszenz bestimmt. Auf diese Weise wurden 39 Phosphatasen identifiziert die potentiell die Antwort auf DNA-Schaden und den Tumorsuppressor p53 regulieren. Unter anderem wurde die dual specificity phosphatase 18 (Dusp18) als prominenter negative regulator von p53 identifiziert. Die Erschöpfung von Dusp18 induziert die Akkumulierung und Aktivierung von p53 und p21 in einer Reihe von Zelllinien. Knockdown von Dusp18 hatte weder eine signifikante Erhöhung an p53 Modifikationen zur Folge noch konnte eine verringerte Wechselwirkung mit dem negativen Regulator Mdm2 nachgewiesen werden. Die Induzierung von p21 ist abhängig von p53 und Chromatin Immunopräzipitation zeigte ein erhöhtes Binden von p53 an den Promotor p21 in Zellen die mit siRNA gegen Dusp18 transfiziert wurden. Bemerkenswerterweise konnte die Depletion von Dusp18 unabhängig von p53 zur Apoptose führen, jedoch insbesondere in Zellen mit wildtyp p53. Außerdem wurde die Aktivierung der Antwort auf DNA-Schaden Kaskade verstärkt, zu sehen durch die verstärkte Phosphorylierung von Chk2 und H2Ax. Untersuchung des Zellzyklus der Dusp18-depleted Zellen zeigte vermehrte Unterbrechung in G1 und S-Phase, begleitet von verringerter Proliferation dieser Zellen. Schließlich konnte gezeigt werden, dass Transfizierung mit siRNA gegen Dusp18 die Sensitivität von Tumorzellen gegen den S-Phase spezifischen genotoxischen Wirkstoff Gemcitabine erhöht. Folglich kann Depletion von Dusp18 die Proliferation von Tumorzellen hemmen und die Apoptose dieser Zellen fördern. Weiterhin kann Knockdown von Dusp18 den cytotoxischen Effekt von Therapeutika wie z.B. Gemcitabine erhöhen. Diese Ergebnisse bestätigen Dusp18 als neue Phosphatase, die für Überleben und Proliferation von Krebszellen notwendig ist, als Suppressor der Antwort auf DNA-Schaden und der p53-Kaskade ist es damit ein potentielles Target für neue Therapieansätze.The cellular genome is constantly exposed to harmful endogenous and exogenous factors. Unrepaired DNA lesions and mismatches promote genomic instability, a major cause of cancer. Therefore, the prompt recognition and repair of damaged DNA, and the senescence or elimination of cells with persistent damage, are crucial to preserve genomic stability and suppress transformation. These processes depend on a cascade of phosphorylations known as the DNA damage response. The phosphorylation of histone H2Ax on Ser139 is one of the earliest events upon activation of the cascade, and the phosphorylated histone, γH2Ax, serves as a marker of the damaged chromatin areas. Several kinases initiate the signal from the sites of the damage and transduce it to effector proteins, such as the tumor suppressor p53. The activation of p53 induces cell cycle arrest via the increased transcription of the Cdk inhibitor p21, and it promotes apoptosis mainly via the transcription of proapoptotic genes. The balance of phosphorylated versus unphosphorylated proteins regulate most of the known steps in the DNA damage response. Thus phosphatases are expected to act as modulators of this cascade; however, our knowledge regarding their precise role is very limited. To identify novel phosphatases that modulate the response to genotoxic stress, a high-throughput screen was performed using an siRNA library targeting the human phosphatase subunits. UVC irradiation was used to induce DNA damage in siRNA-transfected U2OS cells, an osteosarcoma-derived cell line with wild-type p53. The levels of p53 and γH2Ax were quantified by immunofluorescence in cells previously exposed or non-exposed to UVC irradiation. In this way, 39 phosphatase subunits were identified as potential regulators of the early DNA damage response and the tumor suppressor p53. Among them, the dual specificity phosphatase 18 (Dusp18) was a prominent negative regulator of p53. The depletion of Dusp18 induced the accumulation and activation of p53 and p21 in several cell lines. Dusp18 knockdown did not detectably increase the post-translational modifications of p53, nor did it abolish its interaction with its negative regulator Mdm2. The induction of p21 was p53-dependent, and chromatin immunoprecipitation showed an increased amount of p53 bound to the p21 promoter in cells transfected with siRNAs against Dusp18. Interestingly, Dusp18 depletion alone could induce apoptosis that was not dependent on p53, but was augmented in cells with wild-type p53. In addition, it promoted the activation of the DNA damage response cascade, as detected by the enhanced phosphorylation of Chk2 and H2Ax. Analysis of the cell cycle profile of Dusp18-depleted cells revealed an arrest in G1 and S phases, which was accompanied by reduced proliferation of these cells. Finally, the siRNAs against Dusp18 increased the sensitivity of tumor cells to the S phase specific genotoxic drug gemcitabine. Hence, the depletion of Dusp18 inhibits the proliferation and promotes the apoptotic death of tumor cells. Furthermore, the knockdown of Dusp18 can enhance the cytotoxic effect of therapeutic drugs like gemcitabine. These results identify Dusp18 as a novel phosphatase needed for the survival and proliferation of cancer cells, and as a suppressor of the DNA damage response and the p53 pathway, potentially identifying Dusp18 as a cancer drug candidate