Quantifizierungsstrategien in der optisch schnittbildenden Fluoreszenzmikroskopie

Die Entwicklung von Mikroskopen, die innerhalb eines Experiments Fluoreszenzintensitäten in mehr als fünf Dimensionen aufnehmen können (z. B. Raum, Zeit und Farbe), ermöglicht das Messen von Parametern, die zuvor nicht zugänglich waren. Viele weitere experimentelle Fragestellungen ergeben sich durch die Untersuchung der Korrelationen zwischen diesen Dimensionen. Das Ziel moderner Mikroskopie ist die Extraktion quantitativer Informationen aus bestimmten Korrelationen. Beispielsweise nutzt man in der sog. Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleichung (fluorescence revovery after photobleaching, FRAP) die Korrelation zwischen Zeit und Raum zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten. Im FÖRSTER-Resonanzenergietransfer werden Raum und Farbe zur Bestimmung von molekularen Wechselwirkungen und Konzentrationen miteinander korreliert. Die bildgebenden Systeme müssen sorgfältig kalibriert werden, damit die Korrelationen, die in derartigen Experimenten untersucht werden, die zugrunde liegenden Mechanismen wiederspiegeln. Andernfalls analysiert man Artefakte, die zu falschen Schlüssen (ver-)leiten, und eine Quantifizierung der Parameter erweist sich als unmöglich. Der erste Teil dieser Dissertation hat zum Ziel, die Quantifizierung und Optimierung in der optisch schnittbildenden Mikroskopie zu vereinfachen. Zu diesem Zweck wurde das neue Werkzeug zur Beurteilung der Bildqualität schnittbildender Mikroskope, das sog. sectioned image property chart (SIPchart), fundamental bearbeitet, so dass man ein erweitertes SIPchart (eSIPchart) erhält. SIPcharts erhält man durch die Analyse eines axialen Bildstapels einer extrem dünnen (kleiner 100 nm), gleichförmigen fluoreszierenden Schicht. Durch die pixelweise Modellierung der axialen Intensitätsverteilungen erhält man Parameter-Karten, die eine bestimmte Abbildungseigenschaft im Bildfeld beschreiben, wie zum Beispiel ortsabhängige Intensitätsschwankungen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die eSIPchart-Routine zur Analyse axialer Bildstapel von fluoreszierenden Lösungen entwickelt. In dieser werden folgende Erweiterungen eingeführt: Auf der Grundlage statistischer Analyse werden "zufällige Detektoreinheiten" in die Anzahl detektierter Photonen umgerechnet. Dies ermöglicht die Beurteilung der Qualität der Modellfunktion über eine Karte des reduzierten chi^2-Parameters. Weiterhin kann man nun Konzentrations-Kalibrations-Kurven aufnehmen. Die neu eingeführte VOIGT-Funktion liefert einen Wichtungsfaktor, aufgrund dessen die Ausleuchtung der Rückapertur abgeschätzt werden kann. Der Schritt von dünnen Schichten zu fluoreszierenden Lösungen ist aus verschiedenen Gründen von Vorteil: i) Für Kalibration und Experiment kann derselbe Farbstoff verwendet werden. Somit werden Kalibrationsfehler vermieden, die durch ein unterschiedliches Fluoreszenzspektrum oder einen Brechungsindexunterschied des Testpräparates, wie es eine dünne Schicht darstellt, zustande kommen. ii) Fluoreszenzfarbstoffe sind in jedem Labor vorhanden, in dem Fluoreszenzmikroskopie betrieben wird. Sie sind leicht zu erwerben, billig und vielseitig. iii) Eine fluoreszierende Lösung kann mehrere Farbstoffe enthalten, die somit ein großes Fluoreszenzspektrum abdecken. iv) Der Brechungsindex des Lösungsmittels kann auf den Brechungsindex des Immersionsmediums eingestellt werden. Die eSIPchart-Analyse ermöglicht eine präzise Charakterisierung der sphärischen und chromatischen Aberrationen sowie eine Optimierung der Einstellung des Korrekturringes qualitativ hochwertiger Mikroskopobjektive. Abschließend werden die Charakteristika einer bestimmten Mikroskopkonfiguration im eSIPchart übersichtlich zusammengestellt. Das ermöglicht die schnelle Beurteilung der Abbildungseigenschaften sowie der Eignung eines optisch schnittbildenden Mikroskops für ein geplantes Experiment. Der zweite Teil der Dissertation behandelt die Anwendung einer Reihe neu entwickelter Vergleichsmethoden zum Vergleich von drei Mikroskopsystemen. Das ApoTome nutzt zur optischen Schnittbildung strukturierte Beleuchtung durch ein lineares Gitter. Dieses wird einem konfokalen Laser-Raster-Mikroskop (cLSM) und konventioneller Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie gegenübergestellt. Verschiedene Abbildungsparameter werden durch verschiedene Methoden bestimmt: Die axiale sowie die laterale Auflösung werden mit fluoreszierenden Kügelchen und dünnen fluoreszierenden Schichten bestimmt. Die Ortsabhängigkeit verschiedener Parameter wird durch eSIPcharts ermittelt. Die Auflösungsanisotropie wird mittels linear gewachsener Dendriten ermittelt. Diese stammen aus Zellkulturen aus dem Riechhirn der Kaulquappe des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Das Abbildungsverhalten für tief im Gewebe liegende Strukturen wird vermittels mikroinjizierter Mitralzellen aus dem Riechhirn des Krallenfrosches untersucht. Das ApoTome erreicht unter Standardbedingungen, d. h. mit einem Durchmesser der konfokalen Lochblende von 1 A.U. und dem ApoTome-Gitter "VH", eine bessere laterale Auflösung als das cLSM. Das kommt dadurch zustande, dass die Rückapertur im ApoTome homogen ausgeleuchtet wird, während sie im cLSM die (abgeschnittene) GAUSS"sche Intensitätsverteilung des Anregungslasers aufweist. Die axiale Auflösung ist im cLSM mit einer Ausnahme besser als im ApoTome: Dieses übertrifft das cLSM bei der Auflösung niedriger Raumfrequenzen unter Verwendung von Aufnahmeparametern, die auf optimale Auflösung abzielen (cLSM Lochblende = 0.4 A.U. sowie ApoTome, "VL"-Gitter). Im cLSM zeigt die axiale Auflösung eine zentral-symmetrische Verteilung über das Bildfeld, welche hauptsächlich durch Aberrationen entstehen, die mit dem Rasterverfahren zusammen hängen. Demgegenüber ist die axiale Auflösung des ApoTomes homogen innerhalb des Bildfeldes. Die Mikroskopiemethode der strukturierten Beleuchtung mit einem linearen Gitter weist anisotrope Auflösung auf: Lineare Strukturen unterhalb der Auflösungsgrenze werden schlechter aufgelöst, wenn sie die gleiche Orientierung wie das Gitter aufweisen. Im Falle ähnlicher Raumfrequenzen wie das Gitter werden sie kontrastreicher dargestellt. Bezogen auf die optische Schnittbildung ist die untersuchte Form der strukturierten Beleuchtung eingeschränkt auf dünne Präparate, da das POISSON-Rauschen aus den Außerfokusebenen nicht herausgerechnet werden kann. Weiterhin muss das Präparat wenigstens für einige Sekunden stabil sein, da die Aufnahme der Rohdaten für ein einzelnes optisch geschnittenes Bild etwa eine Sekunde dauert.The development of microscopes that can record fluorescence intensity in five and more dimensions in one experiment (e.g. space, time and colour) makes parameters available for the scientific community that were previously beyond reach. A new realm of possibilities is opened by the observation of correlations between these dimensions. The goal of front-end microscopy is the extraction of quantitative information from certain correlations. In fluorescence recovery after photobleaching, for instance, diffusion coefficients are calculated from the correlation of space and time. In FÖRSTER resonance energy transfer imaging molecular interactions and concentrations are determined, and space and colour correlated. To render the correlations that are determined in these experiments as valid, the recording system needs to be thoroughly calibrated. Otherwise artefacts arise that can lead to wrong conclusions, and the quantitation of the parameters is impossible. The first part of this thesis was determined to alleviate quantitation and optimisation in optically sectioning microscopy. For this purpose the new tool for the assessment of imaging quality in optically sectioning microscopes, the sectioned image property chart (SIPchart), was fundamentally re-engineered obtaining the extended SIPchart (eSIPchart). SIPcharts are created by the analysis of an axial image stack of a thin uniform fluorescent layer. A pixelwise fit to the axial intensity distributions yields parameter maps that describe a certain imaging property in the field-of-view, e.g. field-dependent intensity variations. The eSIPchart routine was developed in the course of this thesis to analyse axial image stacks of fluorescent solutions. It implements the following: a statistical analysis is performed with which arbitrary detector units are converted to real photon numbers. These allow the evaluation of the goodness-of-fit with a reduced chi^2-parameter map. They also enable the creation of concentration calibration curves. The implemented VOIGT-fit gives a weight factor, on whose basis the quality of the illumination can be estimated. Great benefit can be taken from the transition from the recording of thin layers to fluorescent solution: i) the same dye can be used for calibration and for imaging. Hence calibration errors caused by deviating wavelengths and refractive indexes of the test sample, i.e. a thin layer, can be excluded. ii) fluorescent dyes can be found in places where fluorescence microscopy is performed. They are easily available, cheap, and versatile. iii) a fluorescent solution can contain several dyes and thus cover a big spectral range. iv) the refractive index of the solvent can be adjusted so that it matches the refractive index of the immersion medium. With the data obtained from eSIPchart analysis, a thorough calibration can be performed for chromatic and spherical aberrations and those which origin from the setting of the correction collar. Finally, the eSIPchart gathers the characteristics of a particular setting in a microscope in a comprehensive manner. It thus becomes possible to judge upon the imaging properties and the suitability of an optically sectioning fluorescence microscope for a designated experiment at a glance. The second part of the thesis deals with the application of a set of custom evaluation tools for the comparison of three microscopy systems. The ApoTome, a linear grid structured illumination microscope, is opposed to the confocal laser scanning microscope (cLSM), and conventional widefield epifluorescence microscopy. Different parameters of imaging are assessed with different techniques: the axial and lateral resolution is measured with subresolution fluorescent beads and thin uniform fluorescent layers. The field dependency is evaluated with eSIPcharts. The resolution anisotropy is measured by using linear dendrites from cell cultures which were repared from olfactory bulb neurons of the larva of Xenopus laevis. Deep tissue imaging is evaluated eventually by using microinjected mitral cells in the olfactory bulb of the same animal. It was found out that the ApoTome achieves a better lateral resolution than a cLSM in standard imaging conditions, that is with a confocal pinhole diameter of 1 A.U. in the cLSM and the recommended grid ``VH"" in the ApoTome. This is because the ApoTome"s backfocal plane (BFP) is illuminated homogeneously, whereas the cLSM"s BFP is illuminated with the clipped GAUSSian intensity distribution of a laser. The axial resolution is better in the cLSM than in the ApoTome with one exception: the ApoTome exceeds the cLSM in the resolution of low spatial frequencies recorded at optimal resolution conditions (cLSM pinhole = 0.4 A.U. and ApoTome, ``VL""-grid). The axial resolution in the cLSM has a central-symmetric distribution over the field-of-view, mainly due to scanning-related aberrations, whereas the ApoTome"s axial resolution appears to be homogeneously distributed over the field-of-view. Grid-structured illumination microscopy features anisotropic resolution and selective enhancement of structures in the sample that have the same orientation and frequency as the grid. Structured illumination microscopy is restricted to thin specimens because POISSONian noise contributions from out-of-focus fluorescence cannot be removed. In addition to that, the sample needs to remain stable for at least some seconds since the acquisition of the raw data for one optically sectioned image lasts approx 1 s