Charakterisierung des frühen endosomalen SNARE Komplexes

SNARE Proteine sind wichtige Faktoren in Membranfusion. Diese Proteine sitzen in gegenüberliegenden Lipid-doppelschichten und bilden vier-helix coiled-coil Komplexe, die je ein Qa-, Qb-, Qc- und ein R-SNARE enthalten. Die Ausbildung des SNARE Komplexes fusioniert die Membranen. Syntaxin 13, vti1a, syntaxin 6 and VAMP4 sind als die SNARE Proteine identifiziert worden, die die Fusion von frühen Endosomen vermitteln. Der Kern-Komplex wurde aufgereinigt und biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Die Kristallstruktur wurde mit einer Auflösung von 2.7Å gelöst. Der Komplex zeigt hohe Übereinstimmung mit dem neuronalen und späten endosomalen SNARE Komplex in Bezug auf die Thermostabilität, biochemisches Verhalten und Struktur. Proteoliposomen, die diese Proteine enthalten, fusionieren schneller als Liposomen mit den neuronalen SNAREs. Die Fusion kann mit löslichen Fragmenten der Proteine in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibiert werden. Verwandte und auch nicht verwandte R-SNAREs inhibieren die Liposomenfusion. Liposomen die nicht-verwandte R-SNAREs enthalten fusionieren mit den frühen endosomalen Q-SNARE-liposomen und zeigen daher ein promiskes Verhalten. Dies wurde nicht gezeigt in einem zellfreien, mikroskopischen Assay mit PC12 frühen Endosomen, in dem die löslichen Fragmente nur der frühen endosomalen SNAREs starke und spezifische Inhibierung zeigten.SNARE proteins are crucial factors in membrane fusion. These membrane proteins assemble to four-helix coiled-coils consisting of four SNARE helices: Qa, Qb, Qc and R, thereby fusing opposing membranes. Syntaxin 13, vti1a, syntaxin 6 and VAMP4 were identified as the cognate SNAREs that mediate early endosomal fusion. The core SNARE complex was purified, characterized using biophysical methods, and the crystal structure was solved with a resolution of 2.7 Å. The complex shows high similarity to the neuronal and the late endosomal complexes in terms of thermostability, biochemical behaviour and structure. Proteoliposomes containing these SNAREs fuse faster than proteoliposomes with the neuronal SNAREs and fusion can be inhibited in a dose dependent manner using soluble fragments of the cognate R- and Q-SNAREs, as well as the non-cognate R-SNAREs synaptobrevin and endobrevin. Furthermore, liposomes containing these non-cognate R-SNAREs fuse with the early endosomal Q-SNARE-liposomes, thus exhibiting a promiscuous behaviour. This was not observed in a cell free, microscope-based, fusion assay, where soluble fragments of the proteins showed strong and specific inhibition of homotypic fusion of early endosomes from PC12 cells