Quantitative analysis of Förster resonance energy transfer from spectrally resolved fluorescence measurements

Die Arbeit beschreibt eine neuartige Methode zur Analyse von "Förster Energie-Transfer (FRET)"Signalen. Die Methode stellt eine allgemeine Lösung für Schätzwerte der apparenten FRET-Effizienz bereit, die sich entweder auf Fluoreszenzlöschung des Donors oder auf sensibilisierte Fluoreszenz des Akzeptors beziehen. Daneben werden Schätzwerte für die Gesamtkonzentration von Donor und Akzeptor geliefert. Die eventuelle Gegenwart von freien Donor- und Akzeptorfluorophoren wird berücksichtigt. Korrekturen für das Übersprechen zwischen spektralen Komponenten - sowohl was Anregung als auch was Emission betrifft - sind integrale Bestandteile der Methode. Eine Realisierung der Methode am Spektralphotometer zeigt auf, dass zwei der häufigsten Fehlerquellen von FRET-Messungen identifiziert und korrigiert werden können: Bleichung und Protonierung der Fluorophoren. Weitere Anwendungen der Methode zeigen ihr Potential molekulare Interaktionen quantitativ auszuwerten. Für die Anwendung in der Mikroskopie wird zusätzlich eine Analyse des Photonenrauschens geliefert, sowie die Fehlerfortpflanzung behandelt, was das Signal-Rausch-Verhötnis der FRET-Schätzwerte betrifft. Es werden Modelle berechnet, welche das Signal-Rausch-Verhältnis als eine Funktion der Anzahl der detektierten Photonen beschreiben und die Optimierung der Effizienz in der Verwertung der beobachteten `Photone erlauben. Als Anwendung der Methode werden dynamische Veränderungen in der Konzentration von cAMP beschrieben, wobei ein EPAC-basierter FRET-Sensor eingesetzt wird. Es wird gezeigt, dass Einflüsse auf das Signal-Rausch-Verhältnis der FRET- Messungen, wie sie durch Bleichen und Veränderung der FRET-Effizienz bewirkt werden, korrekt vorhergesagt werden können.A novel method for spectral analysis of Forster resonance energy transfer (FRET) signals is presented. This method provides a general solution for donor quenching and acceptor sensitization related apparent FRET efficiencies and corrected total concentration of donor and acceptor molecules present in the sample. Furthermore, fluorescence from both free and interacting donor and acceptor molecules is considered. All corrections for excitation crosstalk and/or emission bleed-through are inherent in the method. Implementation to spectroscopy demonstrates the possibility to identify and correct two of the most common sources of artifacts in FRET measurements, photobleaching and fluorophore protonation. Further application demonstrates the use of this method to quantitatively evaluate intermolecular interaction. In this method s application to microscopy, the signal-to-noise (SNR) of the measurements and propagation of photon shot noise is also considered. Models are developed to characterize the SNR as a function of the number of photons detected and are used to optimize the efficiency of photon use. This method is used to measure dynamic changes in [cAMP] using an EPAC-based FRET sensor. The ability to predict the SNR during the photobleaching as well as changes in FRET efficiency over such dynamic measurement is demonstrated