Analysis of mice deficient in late endosomal SNARE proteins VAMP8/endobrevin and Vti1b

Bei der Fusion von Membranen kommt es zu einem synchronisierten Zusammenspiel von verschiedenen Proteinen. SNAREs spielen dabei eine zentrale Rolle. SNARE-Proteine, die sowohl auf der Vesikel-, als auch auf der Zielmembran verankert sind, interagieren dabei in eine coil-coiled-Struktur miteinander und bilden somit den Core-Komplex aus. Vamp8 ("Vesicle associated-membrane-protein-8), auch als Endobrevin bezeichnet, ist ein säugerspezifisches R-SNARE, das an zwei Komplexen beteiligt ist. Zum einen trägt es zur Fusion der späten Endosomen in Zusammenspiel mit Syntaxin8, Syntaxin7 und Vti1b bei. Zweitens bildet Vamp8 zusammen mit SNAP23 und Syntaxin4 einen Komplex, welcher die Exozytose der zymogenen Granular in dem Acinarzellen des Pankreas vermittelt.Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der physiologischen Funktion von Vamp8 unter Verwendung entsprechender Knockout-Mäusen. Vamp 8 -/- Mäuse entwickeln sich bis zur Geburt normal. In einem Alter von 10 bis 12 Tagen sterben jedoch ein Drittel der Tiere. Diese Mäuse weisen einen fortschreitenden Gewichtsverlust auf, der erstmals ab einem Alter von 8-9 Tagen zu beobachten ist. Die Tiere können in zwei Gruppen eingeteilt werden: Zur Gruppe 1 zählen die Mäuse, die sich später, trotz des geringeren Gewichtes, zu normalen adulten Mäusen entwickeln. In Gruppe 2 kommt es bei den Tieren innerhalb von wenigen Tagen zu einem dramatischen Verlauf des Gewichtsverlustes, der zum Tod führt. Kennzeichen dieser nicht lebensfähigen Vamp8-/- Mäuse ist ein nur halb so großes Körpergewicht gegenüber den Wurfgeschwistern und ein extrem kleiner Thymus Dessen Medulla ist reduziert und eine deutliche Abgrenzung zum Cortex ist nicht zu erkennen. Die sich entwickelnden Thymozyten, einschließlich der CD4-CD8- DN1-4 und CD4/CD8 Population, zeigen eine massive Störungen in der Reifung. Der Thymus der nicht überlebensfähigen Vamp8-/- Tiere weist eine hohe Anzahl an bereits toten Zellen auf, während die Thmyozyten der kleinen, aber gesunden Knockout-Mäuse sensitiver gegenüber apoptotischen Stimuli in vitro reagieren. Es konnte gezeigt werden, dass sich hämatopoetische Vorläuferzellen aus dem Knochenmark der kleinen und kranken Knockout-Mäusen bei Transplantation in RAG2-/-γc-/- Tiere zu funktionsfähigen T-und B-Lymphozyten entwickeln. Dies ist ein Hinweis darauf, dass ein Defekt in den Stromazellen vorliegt, während die thymozytischen Vorläuferzellen nicht beeinflusst werden. Unabhängig davon weisen Vamp8 doppelt-defiziente Mäuse keine Schäden innerhalb der Exozytose, des endosomalen Transports, Phagozytose und der lysosomalen Degradation auf. Dies gibt wiederum einen Hinweis darauf, dass möglicher weise Vamp8 keine essentielle Rolle während der späten Endosomen-Fusionsereignisse spielt.Membrane fusion requires a synchronized interplay between several proteins that form the membrane fusion machinery. SNAREs are the central component of this fusion machinery. Cognate SNARE proteins localized to transport vesicles and their target membranes interact with each other via coiled-coil interaction to form core complexes. Vesicle associated membrane protein-8 (VAMP8) or endobrevin is a mammalian R-SNARE that participates in the formation of two complexes. First, VAMP8 in a complex with syntaxin8, syntaxin7 and Vti1b, mediates the homotypic late endosomal fusion. Second, VAMP8 forms a complex with SNAP23 and syntaxin 4 and mediates exocytosis of zymogen granules in the pancreatic acinar cells. VAMP8 is also required for exocytosis of granules from mast cells and platelets. This study was aimed at understanding the physiological role of VAMP8 using VAMP8 knock out mice. VAMP8-/- mice were normal at birth, however, by 10-12 days of age nearly one thirds of the mice were dead. These one third mice started to loose weight at postnatal day 8-9 (small not sick stage) and after 2-3 consecutive days of weight loss (small and sick stage), the mice died. The survivors became healthy adults but were lighter than littermates. The small and sick VAMP8-/- mice were half the weight of the littermates and had an extremely small thymus. The thymic medulla was reduced to mere remnants and there was no clear cortico-medullary boundary. The developing thymocytes including the CD4-CD8- DN1-4 subsets and CD4/CD8 populations showed a major maturational disturbance. The thymus of small and sick VAMP8-/- mice showed high number of dead cells and the thymocytes from small not sick VAMP8-/- mice were highly sensitive to apoptotic stimuli in vitro. Bone marrow derived hemopoietic progenitors from small and sick VAMP8-/- mice could develop into functional T and B lymphocytes in the RAG2 -/- γc-/- mice, indicating that the thymic stromal cells could be defective in the VAMP8-/- mice but the thymocyte precursors are normal. Hence, VAMP8 is important in proper development and function of thymus in mice and the loss of VAMP8 has severe implications on the thymocytes and the thymic stroma. However processes such as endocytosis, endosomal traffic, phagocytosis and lysosomal degradation are not affected in the cells derived from VAMP8-/- mice, indicating that VAMP8 is probably not essential for the late endosomal fusion events