Identifizierung von Genen im Nucleus Raphe Dorsalis: Regulation durch Chronischen Stress und Citalopram

Es ist bekannt, dass Stress, insbesondere in chronischer Form, zu psychischen Störungen führen kann. Dabei spielt das serotonerge System vermutlich eine entscheidende Rolle, und man nimmt an, dass stressbedingte Störungen in diesem System psychopathologische Entwicklungen begünstigen. Frühere Experimente hatten gezeigt, dass serotonerge Neurone durch Stress aktiviert werden.Aus klinischen Studien ist bekannt, dass die therapeutische Wirkung der heute am häufigsten verschriebenen Antidepressiva, der spezifischen Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (SSRIs), erst nach 2-3 Wochen eintritt. Vermutlich muss sich das Zentralnervensystem erst an die durch die Medikamente veränderten neurochemischen Bedingungen anpassen, bevor die antidepressive Wirkung eintreten kann. Es ist anzunehmen, dass bei diesen allmählichen Anpassungsprozessen Änderungen in der Genexpression stattfinden, über die aber bisher noch wenig bekannt ist. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Genexpression im dorsalen Raphekern untersucht, dem Hirngebiet, in dem sich die serotonergen Neurone befinden, welche das Vorderhirn innervieren. Es wird angenommen, dass die Wirkung von SSRIs vor allem auf der Blockade des Serotonin (5-HT)-Transporters im dorsalen Raphekern beruht.Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Gene identifiziert, deren Expression durch Stress reguliert wird. Dazu wurden männliche Ratten über 5 Wochen unter Verwendung eines Resident-Intruder-Paradigm sozialem Stress ausgesetzt. Aus den dorsalen Raphekernen der Tiere wurde RNA isoliert und dazu die komplementäre DNA (cDNA) generiert. Aus der cDNA der chronisch gestressten Ratten und der Kontrolltiere wurden dann durch Subtraktionshybridisierung diejenigen DNA-Sequenzen isoliert, die unter Stress differentiell exprimiert sind; diese Sequenzen wurden kloniert. Aus der gewonnenen cDNA-Bank wurden folgende Gene für die Quantifizierung der Expression durch Real-time PCR ausgewählt: Zwei Gene, die an Prozessen der Neurotransmission beteiligt sind, das synaptosomal associated protein 25 (SNAP-25) und das synaptic vesicle glycoprotein 2b (SV2b); ein gliales Gen, von dem man annimmt, dass es an neuroplastischen Prozessen beteiligt ist, das N-myc downstream-regulated gene 2 ( NDRG2); die Neuron-spezifische Enolase (NSE), die das Wachstum und das Überleben von Neuronen begünstigt; sowie ein Gen, das vermutlich an der Regulation der Transkription durch Stress beteiligt ist, das CREB-Bindungsprotein (CBP). Die Menge der mRNA für jedes dieser Gene war nach dem chronischen Stress erhöht.Gene, von denen bekannt ist, dass sie die Synthese und die Freisetzung des Neurotransmitters 5-HT direkt regulieren, konnten durch die cDNA-Subtraktionshybridisierung zwar nicht isoliert werden, aber die Expression der mRNA für den 5-HT-Transporter (SERT), den 5-HT1A-Autorezeptor und für Tryptophanhydroxylase (TPH) wurde dennoch durch quantitative Real-time PCR bestimmt. Es zeigte sich, dass nach dem chronischen Stress die Menge der mRNA für SERT und für den 5-HT1A-Autorezeptor gleich groß war wie in der Kontrollsituation, nur die Menge der mRNA für das TPH1-Gen war nach dem chronischen Stress erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, das 5-wöchiger sozialer Stress bei männlichen Ratten im dorsalen Raphekern zu signifikanten Änderungen in der Expression von Genen führt, die an Prozessen der Neurotransmission, der Neuroplastizität und der 5-HT-Biosynthese beteiligt sind, wohingegen die Expression von Genen, welche die Menge des extrazellulären 5-HT direkt regulieren, nach dieser Stressdauer unverändert ist.Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde dann der Einfluss einer chronischen Behandlung mit dem Antidepressivum Citalopram, einem SSRI, auf die Expression der genannten Gene untersucht. Das Medikament wurde den sozial belasteten Ratten für 4 Wochen täglich über das Trinkwasser verabreicht (30 mg/kg/Tag; diese Dosis war vorab in einer Pilotstudie ermittelt worden). Durch quantitative Real-time PCR wurde festgestellt, dass Citalopram in den chronisch gestressten Tieren die Expression der mRNA für SV2b, CBP und NDRG2 wieder normalisiert. Der Effekt von Citalopram auf die mRNA für SNAP-25 war nicht signifikant, und die Menge der NSE-mRNA war nach der Behandlung mit Citalopram sowohl in den nicht gestressten als auch in den gestressten Ratten erhöht.Citalopram hatte differentielle Effekte auf die mRNA für die beiden bekannten TPH-Gene, 1 und 2: TPH1-mRNA wurde durch Citalopram nur im dorsalen Raphekern der gestressten Ratten reduziert, während TPH2-mRNA sowohl in den gestressten als auch in den nicht gestressten Ratten durch das SSRI abnahm. Die mRNA für den 5-HT1A-Autorezeptor jedoch war nur in den gestressten Ratten reduziert, während die Expression von SERT-mRNA durch Citalopram in allen Tieren unverändert blieb. Diese Befunde zeigen, dass Citalopram im dorsalen Raphekern von chronisch gestressten Ratten die Expression von Genen normalisiert, die an der Freisetzung von Neurotransmittern, an neuroplastischen Vorgängen sowie an der Serotoninsynthese beteiligt sind.Der Einfluss von chronischem Stress bzw. der chronischen Behandlung mit Citalopram auf die Proteinexpression wurde durch quantitatives Western-blotting ermittelt. Es zeigte sich, das 5-wöchiger chronischer Stress zu einer signifikanten Zunahme der Expression der SV2b-, des SNAP-25-, des NSE- und des TPH-Proteins führte. Die Expression der Proteine Syntaxin1A und Synaptophysin wurde weder durch den chronischen Stress noch durch das SSRI verändert. Citalopram verhinderte die stressinduzierte Zunahme des SV2b- und des TPH-Proteins, konnte aber der stressbedingten Zunahme des NSE-Proteins nicht entgegenwirken. Aus diesen Ergebnissen kann man schließen, dass die stressinduzierte Zunahme des TPH-Proteins mit der Zunahme des mRNA für das TPH1-Gen korreliert, während die Citalopram-induzierte Normalisierung der Expression des TPH-Proteins mit reduzierter Expression von TPH1- als auch TPH2-mRNA zusammenhängt. Des Weiteren wurde untersucht, ob die beobachteten Änderungen in der Expression von mRNA und Protein auch in der Hippocampus-Formation zu beobachten sind, einem Hirngebiet, das von den serotonergen Neuronen im dorsalen Raphekern innerviert wird. Es zeigte sich, dass die Expression von NSE durch Stress im Hippocampus verstärkt wurde, dass aber Citalopram darauf keinen Einfluss hatte. Im Unterschied zu dorsalen Raphekern, wo Stress/Citalopram die Expression von Syntaxin 1A nicht modulierte, wurde die Expression dieses Proteins im Hippocampus durch den chronischen Stress verstärkt und durch Citalopram wieder normalisiert.Aus diesen Ergebnissen ist zu schließen, dass chronischer Stress die Expression von Genen reguliert, die an Prozessen der Ausschüttung von Neurotransmittern und an neuroplastischen Vorgängen beteiligt sind. Es ist anzunehmen, dass die vorliegenden Daten eine stressinduzierte Verstärkung neuronaler Aktivität im dorsalen Raphekern reflektieren, und dass die Wirkung von Stress bzw. Citalopram spezifisch für diese Hirnregion ist. Die stressbedingte Zunahme des TPH-Proteins spiegelt möglicherweise die verstärkte Aktivität der serotonergen Neurone im dorsalen Raphekern wider. Die durch Citalopram hervorgerufene Normalisierung der TPH-Expression, vermutlich eine wichtige Vorraussetzung für normale Serotoninspiegel im Gehirn, könnte zu der therapeutischen Wirkung des SSRI beitragen.It is known that stress, especially when it is chronic, can lead to mood disorders and changes in the serotonergic (5-HT) system, which most probably play a role in stress-induced neuropathologies. Neurochemical measures indicated that serotonergic neurons in the dorsal raphe nucleus (DRN) are activated by stress. Clinical studies have shown that the therapeutic effect of antidepressants, including specific serotonin re-uptake inhibitors (SSRIs), occurs only after 2-3 weeks of chronic treatment. This lag phase may indicate that antidepressants change central nervous gene expression in a time dependent manner, however, little is known about such processes in stressed subjects. The aim of the present thesis was to identify genes in the rat DRN that are regulated by chronic social stress and to investigate whether these genes are regulated by the selective SSRI citalopram.The first part of the thesis describes the identification of genes that are differentially expressed by chronic social stress in the DRN. Using a resident intruder paradigm, male Wistar rats were chronically stressed by daily social defeat during 5 weeks. RNA was isolated from their DRN, cDNA was generated, and subtractive cDNA hybridization was performed to clone sequences that are differentially expressed in the stressed animals. From the cDNA libraries that were obtained, the following genes were selected to quantify mRNA expression using quantitative real-time PCR: Two genes related to neurotransmission, synaptosomal associated protein-25 (SNAP-25) and synaptic vesicle glycoprotein 2b (SV2b); a glial gene presumptively supporting neuroplasticity (N-myc downstream-regulated gene 2, NDRG2); neuron specific enolase (NSE) that is known to promote neuronal growth and survival; and a gene possibly related to stress-induced regulation of transcription, CREB binding protein (CBP). Expression of mRNA for these genes was significantly upregulated in the DRN of chronically stressed rats. Genes directly related to 5-HT neurotransmission could not be identified by subtractive cDNA hybridization which may suggest that their expression is not regulated by stress. However, quantitative real-time PCR was nevertheless performed for the serotonin transporter (SERT), the 5-HT1A autoreceptor and the tryptophan hydroxylase (TPH) genes 1 and 2. It was found that only TPH1 mRNA was upregulated by chronic stress. These data reveal that 5 weeks of daily social defeat leads to significant changes in the expression of genes related to neurotransmission, neuroplasticity and 5-HT synthesis in the DRN, whereas expression of genes directly related to 5-HT release is apparently normal after this period of chronic stress.The second part of the thesis was designed to investigate the impact of a chronic citalopram treatment (30mg/kg/day, for 4 weeks administered via drinking water) on the mRNA expression of the above described genes in the DRN. The appropriate dose of citalopram was determined in a pilot study. Real-time PCR showed that citalopram normalized the stress-induced upregulation of mRNA for three genes: SV2b, CBP and NDRG2. The SSRI had no significant effect on SNAP-25 mRNA, but upregulated the expression of NSE mRNA in both stressed and unstressed animals. The potential impact of citalopram on the genes directly related to serotonin transmission was also investigated. It was found that citalopram reduced 5-HT1A autoreceptor mRNA expression only in stressed animals. TPH 1 and 2 genes respond differentially to citalopram. The expression of TPH1 mRNA was normalized only in the stressed animals, whereas TPH2 mRNA was reduced in all treated subjects. These findings demonstrate that in the DRN of chronically stressed rats, citalopram restores mRNA expression of distinct genes involved in neurotransmitter release/ neuroplasticity and 5-HT biosynthesis.To analyze whether stress and citalopram also change protein expression in the DRN, Western blot experiments were performed. These experiments revealed that chronic stress increased the expression of SV2b, SNAP-25, NSE, and TPH protein. Citalopram reversed the stress-induced upregulation of SV2b but had no significant effect on the amount of SNAP-25 protein. Furthermore, expression of syntaxin 1A and synaptophysin protein was not affected by either stress or citalopram. This indicates that stress and citalopram have no global effect on all synaptic/synaptic vesicle proteins in the DRN but that only distinct genes are affected. Stress-induced upregulation of NSE protein was not reversed by the SSRI but instead, citalopram enhanced NSE expression in control animals. The stress-induced upregulation of TPH protein correlated with enhanced expression of TPH1 mRNA, whereas antidepressant-induced normalization of TPH protein expression appears to be due to the reduction in TPH 1 and 2 mRNA.To investigate whether the effects of stress and citalopram on gene expression are confined to the DRN, protein expression was also determined in the hippocampal formation. Data indicated that also in this brain region NSE expression is involved in stress-induced processes, however, citalopram had no effect on hippocampal NSE expression. In contrast to the DRN, hippocampal syntaxin 1A protein was upregulated by stress and normalized by citalopram. In conclusion, the present data demonstrate that chronic stress upregulates the expression of distinct genes involved in neurotransmitter release/neuroplasticity which possibly reflect enhanced neuronal activity. The SSRI citalopram normalizes expression of some of these genes. Furthermore, the changes in gene expression are specific for the DRN indicating a regional effect of stress and citalopram, respectively. The stress-induced upregulation of TPH may reflect enhanced activity of 5-HT neurons, while the SSRI normalized TPH expression. One may speculate that similar mechanisms may contribute to the therapeutic actions of citalopram in patients