Die Entwicklung von Mikrosatelliten bei Bergahorn (Acer pseudoplatanus L.) und deren Anwendung in der Populationsgenetik

Der Bergahorn (Acer pseudoplatanus L.) ist eine in Deutschland und anderen mittel-europäischen Ländern heimische Edellaubbaumart. Die Art ist autotetraploid und gilt als vorwiegend durch Insekten bestäubt, wenn auch mit einem geringen Anteil von Windbestäubung. Trotz der wirtschaftlichen und ökologischen Bedeutung des Bergahorns herrscht über seine genetische Strukturen und sein Reproduktionssystem weitgehend Unkenntnis. Begrenzte Untersuchungen wurden bisher mittels Enzymgenloci angestellt. Indessen sind für die Analyse genetischer Strukturen und des Reproduktionssystems (Paarungs- und Genflusssystem) hochvariable nukleare genetische Marker unentbehrlich. Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Mikrosatellitenmarker zur entwickeln und bei der Untersuchung genetischer Strukturen und des Transports genetischer Information in zwei Populationen des Bergahorns einzusetzen. Die Mikrosatellitenmarker wurden mit dem Verfahren von FISCHER und BACHMANN (1998) entwickelt. Das verfahren beruht auf der selektiven Hybridisierung biotinylierter Olig-Proben mit Kern-DNA und der Anreicherung der Mikrosatelliten mittels magnetischer Partikel. Für die Hybridisierung wurden trinukleotide ((AAC)8 und (GAA)8) sowie eine dinukleotide ((CA)10) Oligo-Proben verwendet. Eine Wiederholung des Anreicherungsschrittes (doppelte Anreicherung) sollte die Effizienz der Mikrosatellitenisolierung erhöhen. Die angereicherten Fragmente wurden in den mit BssH II geschnittenen, doppelt dephosphorilierten pCRscript-Vektor eingebaut und in XL1-Bluebakterien ( superkom-petente Zellen, E. coli) transformiert. 16 der 24 Primer-Paare (d.i. 67%) lieferten Fragmente der erwarteten Größe. Schließlich ergaben acht Primer polymorphe und gut anzusprechende Banden. Die endgültige Effizienz von der angereicherten Kolonie bis zum Erhalt der polymorphen Primer betrug 9%. Zunächst wurden 96 Bäume in der Umgebung von Göttingen mithilfe von 8 Mikrosatelliten charakterisiert. Alle acht Primer wiesen mit 3 bis 16 Allelen einen mittleren bis hohen Grad von Polymorphismus auf. Wie nach der Autotetraploidie des Bergahorns zu erwarten war, variierte die Anzahl verschiedener Allele eines Individuums zwischen 1 und 4. Die Interpretation der jeweiligen Varianten als Produkte eines Genlocus wurde durch Sequenzierung verschiedener Fragmente für jedes Primerpaar nachgewiesen. Insgesamt 80 bzw. 85 Allele traten an den sechs Mikrosatelliten-Genorten in den beiden Populationen auf. Für die deutliche Differenzierung waren die allgemein etwas unausgewogenen (näherungsweisen) Häufigkeitsverteilungen der Allele und die Anwesenheit privater Allele in den beiden Populationen maßgeblich. Fünf Allele in der Naturverjüngung kamen unter den Altbäumen der betroffenden Population nicht vor, waren also durch Externpollen, möglicherweise auch durch Samenmigration, eingetragen. Signifikante genetische Strukturierung wurde in einer Population bis zu einem Abstand von 40m und in der anderen bis zu 300 m festgestellt. Der durchschnittliche maximale Selbstbefruchtungsanteil bei 13 bzw. 8 Bäumen wurde nach dem Ausschlußprinzip mit 11 % geschäzt. Der Anteil externer effektiver Pollen betrug 13 % bzw. 2 % . Die in der vorliegenden Arbeit entwickelten Mikrosateliten wurden in 21 Acer-Arten getestet, um ihre Übertragbarkeit auf diese anderen Arten in Erfahrung zu bringen. In 92% aller Fälle gelang die Amplifizierung von Fragmenten der erwarteten Länge. Praktische Anwendungen der erzielten Ergebnisse werden diskutiert.Sycamore maple (Acer pseudoplatanus L.) is an indigenous hardwood in Germany and in other central-European countries. The species has been reported to be tetraploid (2n=4x=52) and is considered as predominantly insect-pollinated with some degree of wind-pollination. Despite its economic and ecological importance, there exists very little information about the genetic structure and reproduction system of the species. Until now limited studies have been carried out on the basis of isozymes. However, highly polymorphic nuclear genetic markers such as microsatellites are indispensable for the study of genetic structure and system of reproduction (mating system, geneflow). The aim of this dissertation was first to develop microsatellite markers and to use them for the study of genetic structure and transfer of genetic information within two natural populations of A. pseudoplatanus. In order to develop microsatellite markers the protocol developed by FISCHER and BACHMANN (1998) was used which is based on selective hybridization of biotinylated oligo-probes to the genomic DNA and on capturing the fragments containing microsatellites by magnetic particles. Two trinucleotide ((AAC)8 and (GAA)8) and one dinucleotide ((CA)10) artificial oligo-probes were used for hybridization to the genomic DNA of A. pseudoplatanus. Double hybridization was performed to increase the efficiency of microsatellite enrichment. The enriched fragments were ligated into the BssH II, digested, double-dephosphorylated and the gel-purified pCRscript vector. Thereafter, the fragments were transformed into XL1-Blue E. coli. Sixteen out of 24 primer pairs (67 %) produced the expected fragment size. Finally, eight primers produced polymorphic and well-scorable bands. The final efficiency from the enriched colony to getting the polymorphic primers was 9 %. At first these eight primers were characterized in 96 adult trees of a population near Göttingen, Germany. All eight primers show moderate to high levels of polymorphisms producing 3 to 16 alleles. As expected, the numbers of different alleles varied from one to four per individual since the A. pseudoplatanus is an autotetraploid species. The validity of variants as alleles of a single gene locus was proved by sequencing several fragments for each primer pairs. A total of 80 and 85 alleles, respectively, were encountered at six microsatellite loci in two populations. The presence of private alleles in both populations and unbalanced (approximate) frequency distributions of the alleles in both populations are mainly responsible for their pronounced genetic differentiation. Five external alleles were found in the natural regeneration that were not present in the adult trees of the respective population. Significant spatial genetic clustering up to 40 m distance was observed in one and up to 300 m in the other population. The average maximum self-fertilization rate of 13 and 8 trees, respectively, was estimated by the exclusion principle to be 11 %. The percentages of external effective pollen amounted to 13 % and 2 %, respectively. The moderate long-distance transport of effective pollen and the low proportion of self-fertilization find their joint expression in moderate spatial genetic structures and in remarkable genetic differentiation of the two populations. The test of microsatellite markers developed in the present study in 21 other species of the genus Acer produced amplification products in 92% of all cases. Practical applications of the above-mentioned results were discussed