Polymereinbettung für die Anfertigung von Ultradünnschnitten und optische Nanoskopie an dichten fluoreszierenden Proben

In den modernen Lebenswissenschaften wird häufig auf optische Fernfeldmethoden zurückgegriffen, insbesondere weil hierfür diverse spezifische Markierungstechniken zur Verfügung stehen. Dies wurde vor allem durch die Entwicklung von beugungs-unbegrenzten Techniken in den letzten zwei Jahrzehnten, allenvoran der STimulated Emission Depletion Nanoskopie (STED), forciert. Die laterale Auflösungserhöhung bereitete den Weg für eine völlig neue Ära an biologischen Fragestellungen. Die Suche nach einer erhöhten Auflösung in axialer Richtung war kurze Zeit später unabdingbar. Innerhalb dieser Arbeit wird ein anwenderfreundlicher Ansatz für die durchdringende Untersuchung von beliebig dicken Proben mit nanoskopischer Auflösung in drei Dimensionen präsentiert. STED Nanoskopie wird für die Untersuchung von 50-100nm dünnen, mechanisch angefertigten Ultradünnschnitten angewandt. Dieser Ansatz ist sehr vorteilhaft, nicht nur, weil Ultradünnschnitte eine, verglichen mit dem konfokalen Fokus, um ein Zehnfaches erhöhte axiale Auflösung ermöglichen. Besonders hervorzuheben ist die Reduktion des Fluoreszenzhintergrundes aus angrenzenden Ebenen der Probe. Darüber hinaus können einzelne Schichten der Probe unabhängig voneinander mit hoher Auflösung untersucht werden. Somit werden Photobleichen in der fokalen Umgebung, sowie Streuungs- und Abberrationseffekte in der Probe, ausgeschlossen. Zusammenfassend ist die nanoskopische Untersuchung in drei Dimensionen nicht mehr auf aufwendige Experimente, einschliesslich komplizierter experimenteller Aufbauten und computergestützter Datenanalysen, angeweisen. Noch entscheidender ist aber die Möglichkeit, beliebig dicke Proben, wie z. B. ganze Gewebeblöcke, zu untersuchen.Optical far-field methods are frequently recruited in modern life sciences, especially because one can benefit from various kinds of specific labeling. This was forced even more when several techniques for diffraction-unlimited imaging came up within the last two decades, the first of them STimulated Emission Depletion nanoscopy (STED). The lateral resolution refinement paved the way to a whole new era of addressable biological questions. Inevitably, the call for an enhanced axial resolution arose shortly after. Within this work, a straightforward approach for an entirely three-dimensional investigation of arbitrarily thick samples with nanoscopic resolution is presented. STED nanoscopy is combined with mechanical ultrathin slicing to a section thickness of 50 - 100nm in the axial direction. This approach is highly advantageous, not only because ultrathin sectioning reveals densely packed structures with a, compared to a confocal spot size, tenfold increased resolution in the axial direction. Importantly, the fluorescence background from adjacent layers of the focal plane is avoided. Furthermore, every single layer of a three-dimensional sample can be addressed independently with the optical high resolution provided by STED. Hence, photo-bleaching in the periphery of the focal plane as well as scattering and aberrational effects within the sample are excluded. As a result, three-dimensional nanoscopic investigation is no longer limited to sophisticated experiments, including complex setups or computational deconvolution of the data. Even more important, it can be performed on arbitrarily thick samples, like whole tissue blocks