Conformational switch in proteins and peptides induced by double strand formation in peptide nucleic acid/protein chimera

Die Funktion und Aktivität von Proteinen hängt im wesentlichem von der dreidimensionalen Struktur und der Konformation des Proteins ab. Die Konformationswechsel sowie die Wechselwirkung zwischen Proteinen, beeinflusst durch einen molekularen Schalter, würden maßgeblich zur biologischen Aktivitätsänderung und sowie deren Funktion beitragen. Die als Schalter verwendeten Alanyl-PNA Oligomere sind Oligopeptide mit alternierender Konfiguration und mit Nucleobasen, die an der β-Position der Alanyl-Aminosäure kovalent gebunden sind.Im Rahmen dieser Arbeit wurden Interaktionen und damit die Stabilität von verschiedenen komplementärer Alanyl-PNA Oligomere mit Hinblick auf eine mögliche Schalter -Funktion mittels UV- und NMR-spektroskopie untersucht. Die untersuchten Alanyl-PNA Oligomere unterschieden sich in den Längen und durch die eingebauten Fehlstellen. Weiterhin wurden verschiedene Puffersysteme für die Untersuchungn gewählt. Ein zweiter Punkt dieser Arbeit war der Einbau eines Alanyl-PNA Stranges in ein Peptid oder Protein. Durch Zugabe eines komplementären Alanyl-PNA-Gegenstranges sollte sich ein β-Faltblatt stabilisieren lassen. Weiterhin wurde nach einer effizienten Methode gesucht, um N-methylierte Aminosäurederivate ausgehend von N-Methyl-Serinlacton 42 zu entwickeln und diese in alanyl-PNA Oligomere einbauen zu können. Durch das Ersetzen der C-Terminalen Helix des humanen Interleukin 8 (hIL-8) (Aminosäure 56-77) durch ein alanyl-PNA Hexamer wollten wir eine Schaltung des helicalen C-Terminus zu einer anderen stabilen Konformation erreichen. Der Einbau von alanyl-PNA Oligomere in Peptide und Proteine erweißt sich als schwierig, so dass wir am Ende dieser Arbeit in Kooperation mit dem Arbeitskreis Bordusa eine enzymatische Ligation zum Einbau durchgeführt haben.Der Erste Teil dieser Arbeit, wurden verschiedene Alanyl-PNA Oligomere unterschiedlicher Länge dargestellt, wobei um Aggregationen zu vermeiden auch die nicht komplementäre Nucleoaminosäure Boc-AlaT-OH, sowie die Aminosäuren Lysin und Glutaminsäure eingebaut wurden. Anhand dieser Sequenzen wurden neben der temperaturabhängigen UV Spektroskopie in Kooperation mit der Abteilung Griesinger auch NMR-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Hierbei zeigte sich deutlich, dass die Modifikationen einen Einfluss auf die Selbstpaarung hatten. Der Einbau der geladenen Aminosäuren Lysin und Glutamin führte zu einer Verbesserung der Löslichkeit. Die NMR-spektroskopischen Messungen zeigten, dass die Aggregation in reinen G/C-Alanyl-PNA Oligomeren höher ist als die der Oligomere mit Modifikationen. Eine Rückgratmethylierung versprach Abhilfe hinsichtlich Aggregation im für die NMR-Spektroskopie erforderlichen Konzentrationsbereich. Eine N-terminale N-methylierte Nucleoaminosäure im Oligomer 67 brachte keine Abhilfe bei der Vermeidung der Aggregation. Die Messung zentral eingebauter N methylierter Nucleoaminosäure im Oligomer 68 wird noch NMR-spektroskopisch ermittelt.Viertens, befassten wir uns mit den Schalter Funktionen und somit den Wechselwirkungender alternierenden alanly-PNA Oligomere. Beim Einbau von Alanyl-PNA Oligomeren in β-Faltblatt bildende Peptide, sollte der Einfluss der Alanyl-PNAs und damit die Schaltfähigkeit der Sekundärstruktur untersucht werden. Die Peptid/PNA Sequenz Ac Ser-Pro-Gly-Lys-Thr-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gly-Orn-Lys-Ile-Leu-Gln-Val-Gly-Pro-Gly-Gly-AlaC-AlaC-AlaG-AlaC-AlaG-AlaG-Lys-NH2 (85) konnte hergestellt werden, jedoch nicht mit seinem Gegenstrang zur Paarung gebracht werden. Dies kann auf sterische Faktoren sowie Wechselwirkungen der Nucleoaminosäuren der Alanyl-PNA mit den Aminosäuren aus dem Peptid hinweisen. Um eine bessere Wechselwirkung mit komplämemtären Alanyl-PNA Oligomeren zu erreichen, wurde ein kürzeres, weniger rigides Peptid Ac-Orn-Lys-Ile-Leu-Gln-Val-Gly-Asn-Gly-Gly-AlaC-AlaC-AlaG-AlaC-AlaG-AlaG-Lys-NH2 (87) mit schwächerem turn-Bildner hergestellt. Erwartungsgemäß wurde hierbei ein viel größerer Einfluss des Gegenstranges auf die Peptid/PNA Sequenz beobachtet.Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasste sich mit dem Einbau eines PNA-Hexamers in ein menschliches Interleukin 8 (hIL-8) bzw. in einen Teil dieser Sequenz (Aminosäure 56 bis 77). Es sollte gezeigt werden, dass auch ein Hexamer durch die Technik der native chemical ligation in größere Peptide eingebaut werden kann. Weiterhin, sollte gezeigt werden, dass die Struktur des C-terminalen Endes durch zugabe eines komplementären Gegenstranges in eine stabiele Sekundärstruktur überführt werden kann. Hierfür wurde im Arbeitskreis Beck-Sickinger ein Teil des humanen Interleukin-8 hIL-8 (1-55), als C-terminaler Thioester durch Expression des Fusionsproteins in E. coli und expressed protein ligation.Der letzte Punkt dieser Arbeit war eine enzymatische Ligation in Kooperation mit dem Arbeitskreis Bordusa. Hierbei sollten Alanyl-PNA Oligomere verschiedener Länge sowie N-terminale Nucleoaminosäuren mittels Enzym Clostripain an verschiedene Sequenzen ligiert werden.Die Bordusa Ligationen stellten sich als eine erfolgreiche und gute Methode zum Einbau von Alanyl-PNA in größere Peptide dar. Die manuelle Synthese war nur durch Verlängerung der Sequenz um zwei Glycine möglich. Insgesamt konnte in dieser Arbeit eine viel versprechende neue Synthese zur Darstellung von N methylierten Aminosäuren sowie Nucleoaminosäuren entwickelt und deren Einbau in Oligomere gezeigt werden. Die Ligationsmethode von Bordusa stellt eine sehr effiziente Methode dar, um die Alanyl-PNA Oligomere in große Systeme einzubauen und wird aufgrund dieses Erfolges sicherlich eine gute Option auch zur Darstellung des Interleukin-8 Derivates und weiterer größerer Peptid/PNASequenzen sein. Zur Optimierung dieser Schaltfunktion wäre es denkbar, eine N-metylierte Alanyl-PNA in den Komplementärstrang einzubauen. Eine weitere Möglichkeit zur Optimierung wäre ein Einbau von Aminosäuren gegensätzlicher Ladung in die Oligomere.The activity and properties of proteins mainly depend on the three-dimensional arrangment of their secondary structure elements and their conformation. Conformational changes as well as protein-protein interactions, be influenced by molecular switches, contribute to changes in biological activity and the function of peptide.The molecular switches used are alanyl peptide nucleic acids (alanyl-PNA), alternating oligopeptides based on amino acid alanyl with nucleobases attached to the β-postition.In the present work we studied the interaction and so the stability of diffrent complementary alanyl-PNA oligomers with varying mismatches,lengths and buffers by using UV- and NMR-spectroscopy. Further on, alanyl-PNA was be incorporated in β-sheet forming peptides. In addition, we aimed to develop an efficient method to synthesize N-methylated amino acid derivatives from N-methyl-serinelactone 42 (Figure 61) and incorporate N-methylated nucleoamino acids in alanyl-PNAs. By replacing C-terminal helix of humane interleukine 8 (hIL-8) (amino acids 56-77) with an alanyl-PNA hexamer we wanted to switch from a helical-structured C terminus to nother stable secondary structure. It is very difficult to incorporate alanyl-PNA in peptides or proteins, so that we decided at end our study to performed the enzymatic ligation in cooperation with the Bordusa group.The first aim part of this work was to understand the interaction and so the stability of diffrent complementary alanyl-PNA oligomers with varying mismatches and buffers by using UV- and NMR-spectroscopy. The stability of duplex was investigated by varying the lengths of different alanyl-PNA oligomers. To avoid aggregation problems, we incorporated Boc-AlaT-OH or amino acids lysine and glutamine as a mismatch. The structure and the conformational changes of this sequences were investigated by temperature- dependent UV- and NMR-spectroscopy. We found that a modification increased/reduced the selfpairing. In order to increase the solubility of alanyl-PNA oligomers, amino acids lysine and glutamine were incorporated. NMR-spectroscopy revealed higher aggregation in pure G/C-alanyl-PNA than in the modified oligomers.To avoid aggregation the oligomere 68 with a central incorporated N-methylated nucleoamino acid was prepared. In addition, the complementary alanyl-PNA with charged N-alkyl chains was prepared to enable NMR-spectroscopy measurements blocking one aggregation side.The fourth goal of this work was to investigat interactions of alternating alanyl-PNA oligomeres as molecular switches. Based on the specific nucleobase recognition, the two complementary alanyl-PNA hexamers provide a stable double strand with linear topology. Considering this, one alanyl-PNA hexamer was inserted in a peptide or protein to stabilize a β sheet conformation. Alanyl-PNAs randomly brought together from a single strand. Two complementary strands are able to form duplex, resulting in the β-strand conformation. Next, alanyl-PNA was incorporated eigther in the model peptide or in proteins to function as a distrurbed β-sheet (PNA double strand). As sutch the duplex formed a switchable de-/stabilizing element of protein conformation.Further on, alanyl-PNA was incorporated in β-sheet forming peptides as well as in proteins in order to function either as a part of a β-sheet (PNA double strand) or a disturbed β-sheet (PNA single strand). The peptide/PNA sequence Ac Ser-Pro-Gly-Lys-Thr-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gly-Orn-Lys-Ile-Leu-Gln-Val-Gly-Pro-Gly-Gly-AlaC-AlaC-AlaG-AlaC-AlaG-AlaG-Lys-NH2 (85) was synthesized, but the recognition of the complementary alanyl-PNAs failed. This could be due to the sterical or electronical interactions between the nucleoamino acids (alanyl-PNA) and the amino acids of peptide. Becuse of this, and a shorter and less rigid peptide containing a weaker β-turn Ac-Orn-Lys-Ile-Leu-Gln-Val-Gly-Asn-Gly-Gly-AlaC-AlaC-AlaG-AlaC-AlaG-AlaG-Lys-NH2 (87) (Figure 60) was synthesized. A much more intensive influence was measured between complementary alanyl-PNA and peptide/ PNA sequence, confirming our hypotheses.As fifth part of this work, the C-terminal helix of humane interleukine 8 (hIL-8) (amino acids 56-77) was replaced with a peptide sequence that contained an alanyl-PNA hexamer with the intention to switch from a structured C terminus to a stable secondary structure. In the present approach the native chemival ligation was applied to obtain protein/alanyl-PNA-chimera that allows to switch the protein conformation and to modify the protein interaction by the base pairing. Interleukin 8 is the first example we already obtained the preliminary data from. The fragment hIL-8 (1-55) was expressed in E. coli by the IMPACT system and purified by the Beck-Sickinger group. A last aim, was an enzymatic ligation in coorperation with the Bordusa group. For this reason, it was necessary to synthesize alanyl-PNA oligomeres of different lenghts and N-terminal nucleo amino acids. The ligation step was done by using different sequences and clostripain as an enzyme (Figure 61 ).Bordusa ligation formed out to be a promising method to incorporate alanyl-PNA in peptides or proteins. The existence of 70 with SPPS (solid phase peptide synthesize), was made possible by extending it s sequence with two glycines. In conclusion, this work describes a novel method to synthesize N-methylated amino and nucleo amino acids and incorporated them in alanyl-PNA oligomers. We suggest that the Bordusa ligation methode is an efficient strategy to incorporate into alanyl-PNA in peptides and proteins. Furthermore, to optimize/prevent the switching attachement and aggregation problems a N-methylation over this peptide backbone to one or more central nucleo amino acids of the strand would be done