Transition of intrinsically unfolded α-synuclein into the fibrillar state characterized by NMR spectroscopy

Proteine falten in eine geeignete Konfiguration, die sog. native Struktur, um ihre zelluläre Funktion zu erhalten. Eine nicht-native Struktur verursacht Fehlfunktionen des Proteins und ruft entsprechende Erkrankungen hervor. Solche Fehlfaltungen wurden als gemeinsamer pathogener Prozess in vielen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer- und der Parkinson-Krankheit entdeckt. Bei der Parkinson-Krankheit (PK) findet man das Protein α-Synuclein (αS) als Hauptkomponente der Lewy Bodies, proteinreicher Aggregate, die durch die Amyloidfibrillenform des αS gebildet werden. Unter Berücksichtigung des Charakters eines intrinsisch entfalteten Proteins ist die Strukturänderung während der PK sehr interessant für Biophysiker, die ein Verständnis von Proteinfaltung und fehlfaltung erlangen wollen, und detaillierte Informationen können therapeutische Erfolge bei der Behandlung der PK liefern.In dieser Arbeit ist der Übergang des intrinsisch entfalteten αS zu Amyloidfibrillen mithilfe von NMR-Spektroskopie und biophysikalischen Methoden untersucht worden. Nativ entfaltete Proteine spielen eine Schlüsselrolle in normalen und pathologischen Prozessen. Wenn man nativ entfaltete Proteine wie αS in schwach orientierenden Medien untersucht, zeigen sich überraschend variable NMR dipolare Kopplungen als Funktion der Position entlang der Aminosäurekette, was auf die Existenz von partieller Sekundär- oder Tertiärstruktur hinweist. In Kapitel 3 ist gezeigt, dass die Variation der NMR dipolaren Kopplungen und heteronuklearen Relaxationsraten in αS mit der Variation der Sperrigkeit der Aminosäure entlang der Polypeptidkette korreliert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Sperrigkeit der Aminosäuren die lokale Konformation und Dynamik von αS und anderen nativ entfalteten Proteinen bestimmt. Abweichungen von der Random-Coil-Struktur können Aufschluss über restliche Sekundärstruktur und transiente langreichweitige Tertiärkontakte in entfalteten Proteinen geben. Der Übergang von einer nativ entfalteten Konformation zu Amyloidfibrillen beginnt mit einer Veränderung der Monomerstruktur. Wie bereits zuvor gezeigt wurde, nimmt αS unter physiologischen Bedingungen eine auto-inhibitorische Konformation ein. Änderungen der Umgebung wie niedriger pH-Wert, Zugabe von molecular crowding -Substanzen, hohe Temperatur und/oder hohe Salzkonzentrationen beschleunigen die Aggregation von αS. Unter diesen Bedingungen kann sich αS in ein leicht aggregierendes, partiell entfaltetes Intermediat transformieren. Solche Veränderungen wurden bei einem pH-Wert von 3 mithilfe von CD, SAXS und Fluoreszenz beobachtet. Wie in Kapitel 4 beschrieben, wurde NMR-Spektroskopie verwendet, um solche Konformationsänderungen mit atomarer Auflösung zu untersuchen. Kapitel 5 beschreibt die Untersuchung des Amyloidfibrillenkerns des Wildtyps (wt) im Vergleich zu der genetischen Mutante A30P. Es wurde dabei der Vorteil der HR-MAS NMR-Spektroskopie ausgenutzt, flexible Regionen in Amyloidfibrillen detektieren zu können. Zusammen mit Wasserstoff/Deuterium-Austauschexperimenten (H/D-Austausch) konnte die Anordnung von -Strängen und Schleifen im Fibrillenkern gezeigt werden. Im Vergleich zu wt-Fibrillen wurden für A30P längere Kernregionen der Amyloidfibrillen gefunden. Kapitel 6 enthält eine kurze Beschreibung der Konformation von αS-Oligomeren, die aus Amyloidfibrillen in unterkühlter wässriger Lösung erhalten wurden. Elektronenmikroskopie und Atomkraftspektroskopie (AFM) enthüllen eine kugelförmige Struktur mit Variationen in Durchmesser und Höhe. Diese Arbeit wird in Kombination mit physiologischen Untersuchungen zu einem besseren Verständnis der Intermediate der Amyloidfibrillenbildung führen.Proteins fold into appropriate configuration, called native structure, in order to achieve its cellular function. A protein with nonnative structure induces malfunction and causes the relevant disease. Such protein misfolding has been revealed as a common pathogenic process in many neurodegenerative diseases like Alzheimer s and Parkinson s disease. In Parkinson s disease (PD), a protein called α-synuclein (αS) is found a major component of Lewy body, a proteinaceous aggregate with amyloid fibril form of αS. Considering its character as an intrinsically unfolded protein, the overall change of conformation during PD is quite attractive for biophysicist to understand protein folding and misfolding, and the detailed information can lead to a therapeutic achievement for the treatment of PD.In this thesis, I have investigated the transition of an intrinsically unfolded αS into amyloid fibril with NMR spectroscopy and various biophysical methods. Natively unfolded proteins play key roles in normal and pathological biochemical processes. When confined in weakly aligning media, natively unfolded proteins such as αS display surprisingly variable NMR dipolar couplings as a function of position along the chain, suggesting the presence of residual secondary or tertiary structure. In Chapter 3, it is shown that that the variation of NMR dipolar couplings and heteronuclear relaxation rates in αS closely follows the variations of the bulkiness of amino acids along the polypeptide chain. The results demonstrate that the bulkiness of amino acids defines the local conformations and dynamics of αS and other natively unfolded proteins. Deviations from this random coil behavior can provide insight into residual secondary structure and long-range transient interactions in unfolded proteins. The transition from natively unfold conformation into amyloid fibril starts with a change in monomeric conformation. Previously it has been shown that αS adopts an autoinhibitory conformation in physiological condition. Changes in environmental factors like low pH, molecular crowding agents, high temperature, and/or high salt concentration accelerate αS aggregation. In these conditions, αS may transform into an aggregation-prone, partially folded intermediate, and such dimensional change at pH 3 was observed with CD, SAXS and fluorescence. As described in Chapter 4, NMR spectroscopy was applied to address such conformational change in atomic resolution. Chapter 5 describes the distinction between wt and A30P, a genetic mutant of αS, amyloid fibril core. Here we took the advantage of HR-MAS NMR spectroscopy to detect flexible regions in amyloid fibrils. Together with hydrogen/deuterium (H/D) exchange experiments, the arrangement of β-strands and loops in fibrillar core region is shown. Longer amyloid fibril core region for A30P is observed compared to wt amyloid fibril; the reason for the difference, however, should be addressed. Chapter 6 consists of a brief description about the conformation of the αS oligomer derived from amyloid fibril in supercooled aqueous solution. Electron microscopy (EM) and atomic force microscopy (AFM) reveals spherical conformation with variation in diameter and height. This study, combined with physiological investigation, would lead better understanding of the intermediates in amyloid fibril formation