Identifizierung von Xylemsaft-induzierten Genen im vaskulaeren Pathogen Vertcillium longisporum mittles einer verbesserten cDNA-AFLP Methode fuer transkriptomweite Expressionsstudien

Die funktionelle Transkriptomik ist grundlegend in der heutigen biologischen Forschung. Vergleichende Analysen von Transkriptomen verschiedener physiologischer oder entwicklungsspezifischer Stadien ermoeglicht die Erkenntnis von Genen und ihrer biologischen Funktionen. In dieser Arbeit wurde die Methode des cDNA-AFLPs (cDNA-amplified fragment length polymorphism) gewaehlt, um Gene zu identifizieren, die eine Rolle in der Pathogenese von Verticillium longisporum bei der Infektion von Raps (Brassica napus) spielen. cDNA-AFLP benoetigt keine Vorkenntnisse ueber Gensequenzen und ist damit ubiquitaer anwendbar zur Entdeckung neuer Gene.Eine uneinheitliche Verteilung von Restriktionsschnittstellen bei der Erzeugung von cDNA Fragmenten beieinflusst das cDNA-AFLP im negativen Sinn. Einige Transkripte werden mehrfach repreasentiert, waehrend andere nicht detektiert werden, was zu Redundanz und zu unbefriedigenden Erfassungsraten von Trankripten fuehrt. Zur Verbesserung der Erfassung in der cDNA-AFLP Methode ohne einen Anstieg der Redundanz wurde ein modifiziertes cDNA-AFLP Protokol entwickelt. Immobilisierte cDNA wird sequenziell mit mehreren Restriktionsendonukleasen verdaut und die dadaurch freigesetzten cDNA Fragmente werden in exklusiven Pools gesammelt. Zur Pruefung der neuen Methode wurde eine Software auf der Basis von PERL entwickelt, genannt MECS (Multiple Enzyme cDNA-AFLP Simulation). Mittels Simulationen basierend auf EST Datensaetzen von Arabidopsis, Maus and Mensch zeigte sich, dass die neue cDNA-AFLP Strategie den klassische Protokollen in punkto Erfassung, Redundanz, Fragmentlaenge, und totale Anzahl von PCRs ueberlegen ist, wobei die Anwendung von 2 "marking" und 3 "releasing" Enzymen empfohlen wird.Des Weiteren wurden Untersuchungen von Quellen der Varianz in der Elektrophorese-basierenden Transkriptomik (cDNA-AFLP) gemacht. Dabei wurden Vergleiche in der Separation und der Detektion von amplifizierten cDNA Fragmenten ueber Flachbettpolyacrylamidgel-basierenden und Kapillarelektrophorese (DNA sequencer) durchgefuehrt. Die Kapillarelektrophorese zeigte eine geringere Datenvarianz. Die totale Varianz wurde aufgespalten in die einzelnen Beitrage der cDNA Synthese, Adapterligation, Preamplifikation, Amplifikation und der Elektrophorese. Den groessten Beitrag zur Varianz trug die Preamplifikation bei, was diesen Schritt fuer Verbesserungen praedestiniert. Des Weiteren wurden Paramater der Computer-gestuetzten Bandenerkennung und -paarung untersucht und Strategien zur Verbesserung der automatischen Bandenpaarung entwickelt, die auf eine zweimalige Bandendetektion mit unterschiedlichen Grenzwerten der Bandensignalstaerke beruhen. Die Datenqualitaet der cDNA-AFLP Experimente waren vergleichbar mit denen bekannt aus der Microarray Hybridisierung. Allerdings war die Varianz im cDNA-AFLP unabhaengig zur Signalstaerke, waehrend Microarraydaten zu hoeheren Varianzen bei geringen Signalstaerken tendieren.Das Transkriptom von V. longisporum wurde untersucht nach der Behandlung des Pilzes mit Xylemsaftextrakten der Wirtspflanze B. napus unter Anwendung der verbesserten cDNA-AFLP Methode. Ziel war es, Gene zu identifizieren, die speziell bei der Besiedlung des Xylems durch den Pathogen induziert werden. Unter 13000 cDNA-AFLP Signalen, die untersucht wurden, zeigten nur 34 eine Veraenderung in der Expression durch die Behandlung. Ueber reverse Transkription und real-time PCR wurden 21 klonierte und sequenzierte Transkripte getest und fuer 9 Transkripte konnte eine differentielle Expression bestaetigt werden. Die Expression dieser Kandidatengene wurde anschliessend in planta getestet und fuer 8 Transkripte zeigte sich auch hier eine Regulation im Vergleich zu in vitro Kulturen. Die Identifizierung von regulierten Genen speziell nach der Behandlung mit Xylemsaftmetaboliten aus Verticillium-infizierten Pflanzen wird unser Verstaendnis ueber die biochemische Interaktion zwischen V. longisporum und seiner Wirtspflanze vertiefen und als ein Beispiel der Interaktion eines vaskulaeren Pathogens mit seiner Wirtspflanzen generell stehen.Die quantitative Genexpressionsstudie von V. longisporum mittels eines genomweiten cDNA-AFLPs laesst erahnen, dass die Anpassung des Pathogens an die Xylemumgebung waehrend der Pathogenese nur durch eine geringe Anzahl an regulierten Genen ermoeglicht wird, die allerdings eine erhebliche Rolle bei der Interaktion mit der Wirtspflanze spielen. Die Sequenzanalyse der identifizierten, regulierten Gene deutet an, dass deren Genprodukte entweder regulatorische Funktionen haben oder bei Aufnahme von Zucker, Adhesion, Apoptose oder bei der Synthese von sekundaeren Metaboliten eine Rolle spielen. Ihre Funktion waehrend der Pathogenese wird durch Infektionsassays mit Gen-inaktivierten und mit Ueberexpressionsmutanten geklaert werden. Reportergenfusionen werden zeitliche und raeumliche Expressionsmuster der Kandidatengene waehrend der Infektion ermoeglichen.Functional transcriptomics is vital in biology. Comparative analysis of the transcriptome in different physiological or developmental stages facilitates the assignment of biological functions to genes. In this work, we chose cDNA-AFLP (cDNA-amplified fragment length polymorphism) differential display to investigate the genes involved in the pathogenicity of Verticillium longisporum infecting oilseed rape (Brassica napus). cDNA-AFLP transcriptomics does not require prior sequence information and can therefore be used as a gene discovery tool. Unequal distribution of restriction sites used to generate cDNA fragments negatively affects the performance of cDNA-AFLP. Some transcripts are represented by more than one fragment while other escape detection, causing redundancy and reducing the coverage of the analysis. With the goal of improving the coverage of cDNA-AFLP without increasing its redundancy, we designed a modified cDNA-AFLP protocol. Immobilized cDNA is sequentially digested with several restriction endonucleases and the released DNA fragments are collected in mutually exclusive pools. To investigate the performance of the protocol, software tool MECS (Multiple Enzyme cDNA-AFLP Simulation) was written in Perl. Simulation based on EST collections of Arabidopsis, mouse and human revealed that the sequential digestion strategy outperformed other cDNA-AFLP protocols in terms of coverage, redundancy, fragment length, and the total number of PCRs while the use of two marking and three sequentially applied releasing enzymes for each of the marking enzymes is recommended.The sources of variance and errors in electrophoresis-based transcriptomics (cDNA-AFLP) were investigated including a comparison of separation and detection of amplified cDNA fragments in flatbed polyacrylamide gel-based as well as capillary electrophoresis (DNA sequencer). Capillary electrophoresis showed a significant reduction in errors and data variability. The total variance was partitioned into contributions of cDNA synthesis, adapter ligation, preamplification, amplification and electrophoresis. The highest contribution to variance originated from preamplification, indicating that this step should be the primary target of optimization. Parameters of computer-aided band recognition and matching were investigated and strategies improving matching success based on double passage with different signal intensity thresholds were developed. The overall quality of data generated by cDNA-AFLP was comparable with microarray hybridisation. Variance of cDNA-AFLP was independent of signal intensity while microarray data showed higher variance for low intensity signals. We analysed V. longisporum transcriptome after treatment with extracts of Brassica napus xylem sap by an improved cDNA-AFLP method with the goal to identify genes which are selectively induced during the colonization of xylem. Among over 13,000 individual cDNA-AFLP signals recorded, only 34 responded to the treatments. Reverse transcription real-time PCR was applied on 21 cloned transcript fragments to confirm their differential expression and 9 transcripts were verified. Further on we analysed the expression of candidate transcripts in planta and found 8 transcripts to be regulated in comparison to in vitro conditions. We expect that the analysis of genes identified in this work, especially after treatment with xylem sap metabolites from infected plants, will deepen our understanding of chemical interactions between V. longisporum and its host occurring in xylem sap and shed light on the interaction of vascular pathogens with host plants in general. Quantitative gene expression profiling of V. longisporum by genome-wide cDNA-AFLP helped us to reveal that adaptation to the xylem environment during plant colonization seems to be achieved by just a small number of regulated fungal genes, which, however, might be important for interaction with the plant. Sequence analysis indicates that the corresponding gene products might be involved in regulation, sugar-uptake, adhesion, apoptosis and the synthesis of secondary metabolites. Their role during pathogenesis can be elucidated by infection assays by gene inactivation and with over-expression mutants. Reporter gene fusions will be helpful in the elucidation of temporal and spatial expression patterns of candidate genes during the infection and colonization processes. We hope that the availability of sequences of genes induced during plant colonization will facilitate the elucidation of molecular adaptation of V. longisporum to parasitic lifestyle within the xylem environment of host plant B. napus