Mode of infection, serological detection (ELISA) and biological control of stem canker of oilseed rape caused by Leptosphaeria maculans (Desm) Ces. & de Not.

Aus Komposterde und der Rhizosphäre verschiedener Pflanzen wurden 109 bakterielle und 19 pilzliche Antagonisten mit einer in vitro-Hemmwirkung gegen Leptosphaeria maculans (Anamorph Phoma lingam), dem Erreger der Wurzelhals- und Stängelfäule an Winterraps isoliert. 58 der bakteriellen Isolate hemmten das Myzelwachstum von L. maculans und Verticllium longisporum auf verschiedenen Nährmedien. Viele der Antagonisten waren auch gegenüber anderen pilzlichen Krankheitserregern des Winterraps, Winterweizens sowie der Zuckerrübe wirksam. Aufgrund einer breiten antibakteriellen Wirkung wurden einige Isolate von den nachfolgenden Versuchen ausgeschlossen. Anhand morphologischer und physiologischer Eigenschaften erfolgte frühzeitig eine taxonomische Einordnung, um human- und phytopathogene Bakterien von den ad planta-Versuchen auszuschließen. Die Bestimmung mit den kommerziellen Testsystemen API und Biolog führte zur Identifizierung von Pseudomonas fluorescens, Serratia plymuthica, Paenibacillus polymyxaund Bacillus circulans. 18 der isolierten Bakterienarten und 3 Stämme aus der Antagonisten-Sammlung wurden für das ad planta-Vorscreening im Gewächshaus ausgewählt. Dabei dienten die Siderophorenbildung auf CAS (35 positive Isolate) sowie eine hohe Chitinase- und ß-1,3-Glucanaseaktivität als Kriterium. Darüber hinaus erfolgte eine Überprüfung der Hemmwirkung auf dem nährstoffarmen Strohextraktagar und bei einer niedrigen Temperatur von 8 °C. Alle ausgewählten Bakterien konnten das Wachstum von L. maculans hierbei deutlich hemmen. In Besiedlungsstudien konnte gezeigt werden, dass ausgehend von einer Samenbehandlung eine deutlich bessere Besiedlung der Rapspflanzen durch die Pseudomonaden und von Serratia plymuthica im Vergleich zu den Gram-positiven Bacilli zu beobachten war. Den Befall der Rapscotyledonen mit L. maculans konnten 20 der getesteten 21 Bakterienstämme bis zu 21 Tage nach der Infektion von 6-8 Tage alten Keimlingen in unterschiedlichem Ausmaß vermindern. Pseudomonas fluorescens Gö2I erzielte einen Wirkungsgrad von 73%. Die Isolate Ps. fluorescens RII2 und KAR1, Paenibacillus polymxya HA3e sowie B. circulans KOM1 und KOM19 reduzierten den L. maculans-Befall um 50%. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden 8 Isolate selektiert und auf ihre Hemmwirkung an Jungpflanzen im Entwicklungsstadium BBCH14/15 untersucht. Hierzu wurde eine naturnahe Infektionsmethode, ohne vorherige künstliche Verletzung der Pflanze, unter Verwendung von Pyknidiosporen und Ascosporen entwickelt. Die Antagonisten wurden als Suspensionen (109 cfu/ml) auf den Wurzelhals und die Stengelbasis der Pflanzen appliziert. Zwei Tage später erfolgte die Infektion mit einer Pyknidiosporensuspension (107/ml). Nach weiteren 49 Tagen wurde der Befall mit Hilfe eines im Rahmen dieser Arbeit entwickelten ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) bestimmt. Von 8 Isolaten erwiesen sich Paenibacillus polymxya HA3e, Ps. fluorescens RII2 und B. circulans Kom19 als sehr wirksam. Die kombinierte Anwendung von HA3e und RII2 konnte die Befallsverminderung der Pflanzen im Vergleich zu den Einzelanwendungen von 53.1 % bzw. 42.3 % auf 85.9 % signifikant erhöhen. Zur Quantifizierung des Befalls wurde ein DAS-ELISA optimiert, mit dessen Hilfe auch die Ausbreitung von L. maculans am Wurzelhals und an der Stängelbasis untersucht wurde. Eine systemische Verbreitung des Pilzes in der Pflanze war nicht zu beobachten. L. maculans breitete sich mit zunehmendem Befall auf- und abwärts am Stängelgrund- und im Wurzelhalsbereich, mit einem Maximum im Bereich von 5 cm um die Infektionsstelle herum, aus. Dieser Bereich wurde für die Befallsquantifizierung herangezogen. Der Einfluss des Pilzbefalls auf die Kornertragsbildung wurde mit Hilfe von Analysen an Einzelpflanzen der anfälligen Sorte Cobra untersucht. Eine enge Korrelation wurde zwischen der Ertragsverminderung und dem Befall (r = -0,7159; p = 0,01) ermittelt. Die Ertragsverminderung bei einem starken Befall betrug 28,3%, bei leichtem Befall lediglich 3,3%. Eindeutig pflanzenwachstumsfördernde Effekte konnten bei der Gießbehandlung mit Ps. fluorescens RII2 und Paenibacillus polymxa HA3e nicht festgestellt werden. Phytotoxische Wirkungen traten allerdings dann auf, wenn die Wurzeln der Rapskeimlinge für eine Stunde in eine 5 x 109 cfu/ml konzentrierte Suspension einer dieser beiden Antagonisten eingetaucht wurden. HPLC-analytisch konnte für Ps. fluorescens RII2 die Bildung der Antibiotika DAPG und Pyrrolnitrin sowie anhand colorimetrischer Tests auch HCN und IAA (>1µg/ml) nachgewiesen werden. Pyrrolnitrin zeigte eine fungizide Wirkung gegen L. maculans im Plättchentest bereits bei einer Konzentration von 2 ppm. Cryorasterelektronenmikroskopisch waren Bakterien auf der Oberfläche von Wurzelhals und Stängelbasis der Rapspflanzen nach deren Behandlung mit einer Xanthan-Antagonistensuspension zu erkennen. Die geringen Populationsdichten könnte darauf hindeuten, dass sich Ps. fluorescens R2II und Paenibacillus polymxya HA3e bei geringen Feuchtigkeiten nur schwach auf der oberirdischen Pflanzenoberfläche etablieren können.109 bacterial and 19 fungal antagonists of Leptosphaeria maculans (Anamorph Phoma lingam), the causal agent of blackleg on oilseed rape, were isolated from compost and rhizosphere of different crops. 58 of the bacterial isolates inhibited the mycelial growth of L. maculans and Verticllium longisporum on different nutrient media. Most of the antagonists were active against further important pathogens on oilseed rape, wheat and sugar beet. A few isolates had been excluded from the following experiments because of their broad antibacterial activity. The isolates had been characterised according to their morphological and physiological properties in order to exclude human- and phytopathogenic bacteria. Some of the isolates were identified as Pseudomonas fluorescens, Serratia plymuthica, Paenibacillus polymyxaand Bacillus circulans using the commercial test kits API and Biolog. Eighteen of the isolated antagonists and three strains obtained from the Institute of Plant Pathology and Plant Protection, University of Goettingen, were chosen for ad planta pre-screenings in the greenhouse. Production of siderophores on CAS (35 positive isolates) as well as high chitinase- and ß-1,3-glucanase activity were used as selection criteria. In addition, antagonistic activity of the twenty-one strains was checked on nutrient-poor straw extract agar, and under low temperature of 8 °C. All bacteria chosen inhibited the growth of L. maculans markedly. Colonization of rape seedlings was more effective when the seeds were treated with fluorescent pseudomonads and Serratia plymuthica compared to the applications with bacillus strains. 20 of the 21 isolates reduced the infection of rape cotyledons with L. maculans (up to 21 dpi) when cotyledons were inoculated with a spore suspension of L. maculans 6-8 days after emergence of seedlings. Cotyledon infection decreased by 73% using Ps. fluorescens Gö2I and by 50% with Ps. fluorescens RII2 and KAR1, Paenibacillus polymxya HA3e, and B. circulans KOM1 and KOM19, respectively. Based on these results, 8 isolates were selected and tested for their efficacy to reduce infection on young plants by L. maculans at growth stage BBCH14/15. To mimic the conditions of a natural infection, a method was developed where plants were inoculated with pycnidiospores and ascospores without any mechanical wounding. The antagonists were applied as a suspension (109 cfu/ml) on the root collar region and stem base of the plants, followed by inoculation with a pycnidiospore-suspension (107/ml) two days later. The infection was quantified 49 dpi by means of an ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). From the 8 isolates tested, Paenibacillus polymxya HA3e, Ps. fluorescens RII2 and B. circulans Kom19 showed high antagonistic activity. A combined application of HA3e and RII2 reduced infection of plants by 85.9%. This was a 32.8 to 43.6% increase in efficacy compared to the single application of the two isolates. Invasion within the root collar and stem base by L. maculans was studied with the help of a DAS-ELISA. Results suggested the lack of systemic spread of the pathogen within the host plant. When plants were highly infected, L. maculans was found above and below the stem base and root collar region in a limited radius of 5 cm apart from point of infection. This area was used to quantify the extent of infection. The susceptible variety Cobra was used to study the effect of fungal infection on seed production on single plant basis. A higher correlation was calculated between yield reduction and extent of infection (r = -0,7159; p = 0,01). A yield reduction of 28.3% and 3.3% was estimated for a severe and slight infection respectively. The effect on plant growth promotion was negligible when the root collar and stem base region were treated with suspensions of Ps. fluorescens RII2 and Paenibacillus polymxa HA3e. However, phytotoxic effects were observed when seedling roots were dipped in a suspension of 5 x 109 cfu/ml of both antagonists for one hour. The production of the antibiotics 2,4-diacetylphloroglucinol (Phl) and pyrrolnitrin by Ps. fluorescens RII2 was verified using HPLC-analysis, while colorimetric tests proved the production of HCN und IAA (>1µg/ml). Concentrations of pyrrolnitrin as low as 2ppm were effective against L. maculans in disc-assay. Colonization of antagonists on the surface of root collar and stem base was visualized by means of a cryo-REM (Raster Electron Microscope) two days after the plants were treated with a xanthan-suspension of the bacteria. But only a faint population density of Ps. fluorescens R2II and Paenibacillus polymxya HA3e could establish on the outer surface of plants above ground