Assessing genetic diversity in Vietnam tea [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] using morphology, inter-simple sequence repeat (ISSR) and microsatellite (SSR) markers

Tee (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) ist wahrscheinlich das weltweit wichtigste Getränk zwei Drittel der Weltbevölkerung trinken allmorgendlich Tee , und es gewinnt als gesundes Getränk weiter an Beliebtheit. Während also die Nachfrage nach Tee stetig steigt, ist die für den Anbau zur Verfügung stehende Fläche begrenzt, was eine Produktivitätssteigerung bei gleichzeitiger Senkung der Produktionskosten erforderlich macht. In diesem Zusammenhang kommt der Züchtung von Tee eine wachsende Bedeutung zu. Aufgrund der Kreuzbestäubung können Teepflanzen nicht in klar getrennte Gruppen eingeteilt werden, um verschiedene Taxa zu identifizieren. Da Kreuzungen üblich sind und Klonen empfohlen wird, kann der verbreitete Anbau von nur wenigen Klonen die genetische Diversität einschränken, wenn nicht Sorge getragen wird, daß Klone verschiedenster Abstammung eingesetzt werden. Informationen zu taxonomischen Charakteristika, genetischer Diversität und der Herkunft von Tee können dabei helfen, Genotypen mit hohem Ertragspotential zu identifizieren, die dann als genetische Ressource zur Verbesserung von kommerziell angebautem Tee dienen können. Vietnam gilt aufgrund seiner langen Tradition sowohl im Anbau als auch im Konsum von Tee als ein Land, dessen Tee eine besonders reiche genetische Diversität besitzt. Die Hauptziele der vorliegenden Untersuchung sind: (1) die Bestimmung der morphologischen Diversität des Tees, der in Vietnams Hauptanbaugebiet, der Provinz Lam Dong, wächst; (2) das Sammeln von Akzessionen wilden Riesen-Shantees, lokalen Tees, ausgewählten bzw. veredelten Tees und importierten Tees, um die genetische Diversität auf molekularer Ebene durch ISSR- sowie SSR-Marker zu bestimmen. Dies soll dazu beitragen, Elternpflanzen für Kreuzungen zu identifizieren und die Anzahl von Akzessionen zu reduzieren, die benötigt werden, um eine große Breite an genetischer Vielfalt zu bewahren. Im ersten Kapitel werden die Grundlagen dieser Studie beleuchtet: Die Haupteigenschaften und -typen der gegenwärtig gebräuchlichen molekularen Marker werden erläutert; es wird ein Überblick über die Biologie des Tees und die weltweite Teeproduktion gegeben; die neuesten Fortschritte bei der Bestimmung von Diversität bei Tee werden vorgestellt; und die Teeproduktion und Teeforschung in Vietnam wird dargestellt. Vietnam gehört zu den führenden teeproduzierenden Länder, dennoch liegt der Ertrag immer noch unter dem weltweiten Durchschnitt. Der Anbau von Tee spielt eine wichtige Rolle im Agrarsektor, besonders im Hochland und den bergigen Regionen. Im zweiten Kapitel wird die genetische Diversität von 31 Akzessionen von Tee aus dem kommerziellen Anbau oder von neuen vielversprechenden Tees aus der Provinz Lam Dong anhand von 34 quantitativen und qualitativen morphologischen Charakteristika dargestellt. Entsprechend der Richtlinien des IPGRI (International Plant Genetic Resources Institute) wurden jeweils der Stamm, das vierte Blatt, ein junger Trieb und die Blüte beschrieben. Ein UPGMA-Dendrogramm und ein Hauptkoordinatendiagramm wurden, basierend auf Euklidischen Distanzen, für 16 quantitative morphologische Datensätze erzeugt. Die Resultate zeigten die große Diversität der Tees in Lam Dong. Alle untersuchten Akzessionen gruppierten sich in vier Gruppen, und alle bekannten chinesischen, Assam- und Shantees waren deutlich als Untergruppen erkennbar. Die Ergebnisse dieser Untersuchung stimmen insgesamt mit den Taxa überein, die derzeit in der lokalen Teeproduktion verwendet werden. Die Bestimmung der genetischen Diversität des vietnamesischen Tees durch molekulare Marker wird in den beiden folgenden Kapiteln vorgestellt. Das dritte Kapitel beschäftigt sich mit der ISSR-Methode, mit der 144 Akzessionen von in Vietnam wachsenden Tees untersucht wurden, um durch ISSR-Marker die genetische Diversität auf molekularer Ebene zu analysieren. Aus allen 144 Akzessionen wurde genomische DNS extrahiert und zunächst mit drei RAPD-Marker untersucht. Aufgrund der geringen Qualität der DNAs konnten nur 71 Akzessionen für die Untersuchung genutzt werden. Die Daten wurden statistisch in einer Clusteranalyse beruhend auf einer Dice-Ähnlichkeitsmatrix und einer Analyse der molekularen Varianz (AMOVA) ausgewertet. Die Anzahl polymorpher Banden lag zwischen zwei und sechzehn je Primer, und die Größe der Fragmente reichte von etwa 325 bp bis 2500 bp. Die geschätzten Werte des Dice-Ähnlichkeitskoeffizienten lagen zwischen 0,09 für die Akzessionen mit der größten Distanz LD97 BL (veredelter Tee) und Yakubita (importierter Tee) und 1,00 für die Akzessionen mit der größten Ähnlichkeit, Chat Tien (lokaler Tee) und Suoi Giang 6 (wilder Riesentee). Die untersuchten Akzessionen wiesen eine größere Variation als in früheren Untersuchungen auf, was auf die großen Unterschiede hinsichtlich des Ursprungs der getesteten Akzessionen zurückgeführt werden kann. Abgesehen von einigen Akzessionen, die isoliert blieben und keiner Gruppe zugeordnet werden konnten, bildeten sich bei einem Ähnlichkeitsgrad von etwa 50 Prozent im UPGMA-Dendrogramm vier Gruppen heraus. Die Ergebnisse zeigten sowohl große Unterschiede jeweils zwischen den Akzessionen von lokalen, wilden, veredelten und importierten Tees als auch große Unterschiede der einzelnen Akzessionen untereinander. Bei der Anwendung von SSR-Markern (Kapitel 4) zeigten sechs von 17 Primerpaaren 115 verschiedene Allele aus 69 Akzessionen. Die Anzahl der Allele pro SSR-Marker variierte von 11 bis 25. Die erwartete Heterozygosität war sehr hoch, sie lag zwischen 0,703 und 0,928. Von den Akzessionen hatten 326 Paare keine gemeinsamen Allele. Der Höchstwert der geschätzten Ähnlichkeit lag bei 0,95, zwischen den ähnlichsten Akzessionen F16 (veredelter Tee) und Ho Nam 1 (importierter Tee). Die Clusteranalyse und die molekulare Varianzanalyse (AMOVA) zeigten eine große Vielfalt sowohl zwischen als auch innerhalb der Akzessionen von lokalen, wilden, veredelten und importierten Tees. Für 51 Akzessionen liegen Ergebnisse hinsichtlich ISSR- wie auch SSR-Markern vor (Kapitel 5). Insgesamt konnten mit sieben ISSR- und sechs SSR-Markern 180 polymorphe Banden generiert werden. Weder durch ein UPGMA-Dendrogramm, noch über die Bootstrap-Werte oder die Hauptkoordinatenanalyse war eine Identifizierung eindeutiger Cluster möglich. Abgesehen von einigen Akzessionen, die vereinzelt und ungruppiert blieben, gruppierten sich bei einem bei 0,39 liegenden Wert des Dice-Ähnlichkeitskoeffizienten 25 Akzessionen von wilden Riesentees, von lokalen, von veredelten und von importierten Tees in nur ein einziges großes Cluster; die verbleibenden gruppierten sich in drei kleine Cluster. In jedem der Cluster waren einige Untergruppen mit dem bestehenden Taxonomiesystem vereinbar, dennoch zeigten die Ergebnisse auch einige Unterschiede zum konventionellen System. Obwohl keine eindeutigen Cluster klar identifizierbar waren, entsprachen die Ergebnisse allgemein mit einigen Ausnahmen der üblichen Klassifikation. Die sehr großen Unterschiede zwischen den Akzessionen von lokalen, wilden, veredelten und importierten Tees als auch die der einzelnen Akzessionen untereinander können auf die breite Herkunft der untersuchten Akzessionen zurückgeführt werden. Die Akzessionen von wildem Riesentee konnten von den übrigen nicht klar unterschieden werden, wahrscheinlich weil es aufgrund der starken Fremdbefruchtung bei Tee häufig zur Introgression aus genetischer Ressourcen des wilden Riesentees in gezüchteten Tee gekommen ist.Tea (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) is probably the most important beverage worldwide and gains further popularity as an important health drink . It is served as daily morning drink for two third of the world population. Although demand of tea increases yearly, the available land for tea cultivation is limited and an increasing productivity with reduced production costs is required. Therefore, tea breeding will be of increasing importance. Known as a cross pollinated plant, tea can not be separated into discrete groups to identify various taxa. Since hybridization is used and clonal propagation is recommended, the widespread cultivation of clonal tea can diminish genetic diversity if care is not taken to use clones of dispersed origin. Information on taxonomic characteristics, genetic diversity and biogeography of tea in the living collections may help in identifying genotypes with high production potential which could be used as genetics resources to improve the commercially grown tea. With a longstanding history of cultivating and consuming tea, Vietnam is believed to be highly rich in genetic diversity of tea. The main objectives of this study are: (1) assessing the morphological diversity of tea grown at Lam Dong province the main tea producing province of Vietnam; (2) collecting accessions of wild giant shan tea, local tea, selected/improved tea, and imported tea to assess the genetic diversity on molecular level by using inter simple sequence repeat (ISSR) and simple sequence repeat (SSR) markers. This will help to identify parents for hybridization and to reduce the number of accessions needed to maintain a broad range of genetic variability. In Chapter 1, the background of this study is reviewed, i.e., the main properties and types of molecular markers presently used; an overview of tea biology and the world tea production; the recent advances of assessing tea diversity; and tea production and research in Vietnam. Vietnam is one of the top producing tea countries, but tea yield is still lower than the world average. Tea production has an important role in the agricultural sector, particularly at the highlands and the mountainous areas. Chapter 2 reports the genetic diversity of 31 tea accessions which are commercially planted or new promising selections in Lam Dong province based on 34 quantitative and qualitative morphological characteristics. The stem, the 4th leaf, young shoot and flower were described following the IPGRI s guidelines. UPGMA-derived dendrogram and principal co-ordinates (PCo) plot were produced based on Euclidean distances for 16 quantitative morphological data. Results showed the high diversity of Lam Dong tea. All tested accessions clustered into 4 groups and all known China, India and Shan teas were clearly separated in sub-groups. The results of this study generally meet with the reputed taxa currently accepted in local tea production. The assessment of genetic diversity in Vietnam tea using molecular markers is presented in chapters 3 and 4. In chapter 3, 144 tea accessions growing in Vietnam were screened by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers to reveal the genetic diversity at molecular level. Genomic DNAs of all 144 accessions were extracted and primarily checked by 3 RAPD markers. Due to the low DNA quality, only 71 accessions were used in the study. The data were statistically exploited via cluster analysis based on Dice similarity coefficient matrix and AMOVA analysis. Among 15 ISSR primers tested, only 7 primers generated 64 polymorphic bands. The number of polymorphic bands generated by a primer varied between 2 and 16 and the size of the polymorphic amplified fragments scored ranged from around 325 to 2500 bp. Estimated Dice similarity values ranged from 0.09, between the most distant accessions LD97 BL (selected tea) and Yabukita (imported tea), to 1.00, between the most similar accessions Chat Tien (local tea) and Suoi Giang 6 (wild giant tea). The tested accessions exhibited more variation than in earlier reports. This great variation may be attributed to the wide variability in origin of the tested accessions. Except for some accessions remaining distinct and ungrouped, at about 50% similarity level, the dendrogram using UPGMA formed 4 clusters. The results showed the high variation between and within local, wild, selected and imported accessions. When using simple sequence repeat (SSR) markers (chapter 4), 6 out of 17 primer pairs detected 115 different alleles from 69 accessions. The number of alleles per SSR marker varied from 11 to 25. The expected heterozygosity was very high, ranging from 0.703 to 0.928. 326 pairs of accessions had no alleles in common. The maximum value of estimated similarity was 0.95, between the most similar accessions F16 (selected tea) and Ho Nam 1 (imported tea). Cluster and AMOVA analysis showed the high variation between and within local, wild, selected and imported accessions. For 51 accessions, results from both ISSR and SSR markers are available (chapter 5). A total of 180 polymorphic bands were generated with 7 ISSR and 6 SSR markers. UPGMA-derived dendrogram, bootstrap values and the PCo plot all showed that no clear clusters could be identified. At the value of 0.39 of Dice similarity coefficient, except for some accessions remaining distinct and ungrouped, 25 accessions of wild giant, local, selected and imported tea were all grouped into one large cluster; the others were clustered into 3 small groups. In each cluster, some sub-groups agreed with the known taxonomy system. However the results also showed some differences to the conventional taxonomy system. Although no clearly distinct clusters could be identified, in general the results met the conventional classification (with some exception). The variations between and within local, wild, selected and imported accessions were very high due to the wide range of origin of the tested accessions. The wild giant accessions are not clearly separated from the other ones, probably because tea is freely cross pollinated and there have been many introgressions from genetic resources of wild giant tea into cultivated tea