Construction of two gene targeting vectors to generate mouse models for CDG-Ia containing the mutations F115L and R137H in the Pmm2 gene.

CDG-Ia ist eine genetisch bedingte Stoffwechselstörung, die eine fehlerhafte Synthese von Glykoproteinen zur Folge hat. Ursache sind Mutationen in der genetischen Information für das Enzym Phosphomannomutase II (PMM2). Inhalt dieser Arbeit ist die Generierung von zwei Gene-Targeting-Vektoren (GTV) und den entsprechenden transgenen embryonalen Maus-Stammzellen, welche jeweils die beiden häufigsten Mutationen R141H und F119L (R137H und F115L im Maus-Genom) tragen. Ausgangsprodukt ist ein Teil des murinen Pmm2-Gens, welcher in einen pBlueScript-Vektor subkloniert wird. Mit gezielter in-vitro-Mutagenese erfolgt das Einbringen der jeweiligen Mutation. Als Selektionsmarker für beide GTV dient ein von zwei loxP- Sequenzen flankiertes Neomycin-Resistenz-Gen (Neo). Die beiden derart konstruierten GTV, welche jeweils die Mutation F115L bzw. R137H beinhalten, werden als linearisiertes Konstrukt durch Elektroporation in embryonale Mausstammzellen transferiert. Nach Überprüfung der erfolgreichen homologen Rekombination wird je ein Stammzell-Klon mit dem Genotyp F115L/WT und R137H/WT mit einem Cre-Rekombinase-Gen transfiziert und die erfolgreiche Entfernung des Neo-Gens überprüft. Mit diesen transgenen Stammzellen sollen hypomorphe Mausmodelle für CDG-Ia generiert werden.CDG-Ia is a metabolic disease caused by mutations in the gene encoding phosphomannomutase II (PMM2) and affecting the glycosylation pathway of glycoproteins. The topic of this paper is the construction of two gene targeting vectors (GTV) and the corresponding embryonic stem cells, including the most frequent mutations R141H and F119L (R137H and F115L in the murine genom) respectively. Starting product is a part of a murine Pmm2 gene being inserted in a pBlueScript vector. Using in vitro site-directed mutagenesis the two mutations are generated. A neomycin resistance gene (neo), flanked by loxP sites, is used as a selectable marker. These two linearized GTV, each including the neo gene and the mutation R137H and F115L respectively are transferred to embryonic mouse stem cells via electroporation. After verification of successful homologous recombination, the transgenic stem cells possessing the genotype F115L/WT and R137H/WT respectively are transfected with a Cre recombinase to eliminate the neo gene. These transgenic stem cells should be used to create hypomorphic mouse models for CDG-Ia