Ein genetisches System zur Untersuchung der Permeabilitätsbarriere des Kernporenkomplexes der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Kernporenkomplexe (NPCs) verbinden das Zytoplasma mit dem Nukleoplasma. Ein unkontrollierter Austausch von Molekülen zwischen diesen Kompartimenten wird durch die Permeabilitätsbarriere der Kernporenkomplexe verhindert. Diese supprimiert einerseits die Passage von inerten Makromoleküle, andererseits aber fördert sie den Transport von Molekülen soweit diese im Komplex mit Kern-Transport-Rezeptoren (NTRs) vorliegen. Ungefähr ein Drittel der Proteine, die den NPC bilden, enthalten so genannte FG Domänen. Diese FG Domänen bilden die Permeabilitätsbarriere. NTRs binden an einzelne FG Motive dieser Domänen und diese Interaktion ist essentiell für die Passage von NTR-Molekül-Komplexen durch den NPC. Auf welche Art und Weise diese Interaktion den beschleunigten Transport von NTR-Molekül-Komplexen durch den NPC ermöglicht, ist jedoch rätselhaft. FG Domänen sind sehr verschiedenartig. Sie unterscheiden sich in ihrer Kohäsionskraft, in ihren FG Motiven, ihrer Länge, der Ladungsverteilung sowie der Sequenz zwischen einzelnen FG Motiven. Die biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften einzelner FG Domänen wurden gut in vitro analysiert. Dennoch ist die in vivo Bedeutung der Eigenschaften einzelner FG Domänen für die Funktionalität der Permeabilitätsbarriere nach wie vor ungeklärt. Bisher wurde versucht Fragen nach der in vivo Bedeutung einzelner FG Domänen zu beantworten, indem mehrere FG Domänen in verschiedenen Kombinationen gleichzeitig in S. cerevisiae deletiert und daraus resultierende Phänotypen analysiert wurden. Wir konnten zeigen, dass bisher berichtete letale Phänotypen in mehrfach FG deletierten Stämmen nicht ausschließlich durch den Mangel an FG Domänen verursacht werden, sondern sich vor allem aufgrund der angewandten Deletionsstrategie ausprägen. Mit einer alternativen Deletionsstrategie können wir nun vielmehr zeigen, dass S. cerevisiae mehr Deletionen von FG Domänen toleriert als vormals angenommen. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag darin zu eruieren welche Eigenschaften von FG Domänen für die in vivo Funktionalität der Permeabilitätsbarriere essentiell sind. Dafür haben wir ein in vivo System etabliert, dass es uns erlaubt die Funktionalität einzelner FG Domänen zu untersuchen, in dem wir die Auswirkungen von Mutationen, Deletionen oder eines Domänenaustausches auf die Lebensfähigkeit von S. cerevisiae analysieren. Mit diesem System können wir zeigen, dass die besonders kohäsiven FG Domänen von Nup100p und Nup116p eine besondere Rolle im Erhalt der Permeabilitätsbarriere spielen und dass sie funktionell nicht durch beliebige FG Domänen ersetzt werden können. Diese Tatsache deutet darauf hin, dass die Fähigkeit zur Bindung von NTRs alleine nicht ausreichend ist um die Funktionsweise der Permeabilitätsbarriere zu erklären. Darüber hinaus legen wir dar, dass die einzelnen Ankerpunkte der FG Domänen in der Kernpore nicht gleichwertig sind. Unsere Ergebnisse stützen jene Modelle, die zur Erklärung der Funktionalität der Permeabilitätsbarriere die kohäsiven Eigenschaften von FG Domänen heranziehen. Allerdings nehmen wir auf Grund unserer Ergebnisse an, dass sowohl eine exzessive Präsenz von kohäsiver FG Masse als auch deren Abwesenheit zum Zelltod führt.All nucleocytoplasmic transport occurs through nuclear pore complexes (NPCs). To hinder uncontrolled mixing of cytoplasmic and nuclear content, NPCs maintain the permeability barrier that suppresses passage of inert macromolecules but allows facilitated translocation of even very large cargoes provided these are bound to nuclear transport receptors (NTRs). About a third of the proteins that built up the NPC contains so-called FG domains that are essential for establishing the NPC permeability barrier. NTRs bind to FG motifs and this interaction is essential for their privileged passage. How this binding accelerates NPC passage is one of the enigmas in the field. FG domains are quite diverse, di ffering in their cohesiveness, in their FG motifs, their length, their charge distribution, and in the sequence of the spacers between the individual FG motifs. The biophysical and biochemical properties of individual FG domains have been well studied in vitro. The signi cance of most of the observed features for the functionality of the permeability barrier in vivo, however, so far remained unclear. Previously, the in vivo signifi cance of individual FG domains was studied by generating S. cerevisiae deletion strains lacking multiple FG domains in various combinations. We show that previously reported lethal phenotypes of the combined deletion of FG domains were not exclusively caused by the deletions but were a result of the previously applied deletion strategy. Moreover, with an alternative deletion strategy, we show that S. cerevisiae tolerates more FG domain deletions than expected so far. The focus of this thesis has been to elucidate which FG domain features are essential for permeability barrier function in vivo. We established an in vivo system allowing to analyze the functional contribution of individual FG domains by testing the consequences of mutations, deletions, or exchange of these domains for cell viability. Employing this in vivo system, we find that the very cohesive FG domains of Nup100p and Nup116p play a prominent role in maintaining the permeability barrier. We show that not all FG domains can functionally replace these prominent FG domains, suggesting that NTR binding alone is not su cient to explain the functionality of the permeability barrier. Additionally, we show that the anchor points for FG domains within the NPC are not equivalent. Our findings support models of permeability barrier functionality that rely on the cohesiveness of FG domains. Based on our results, we, however, assume that both the excessive presence of cohesive FG mass as well as the absence of very cohesive FG domains is incompatible with viability