detection and purification of abscisic acid-binding proteins in the cytosol of spinach and Arabidopsis plants

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, cytosolische ABA-bindende Proteine aus Pflanzenextrakten zu isolieren und nachzuweisen. Dazu wurden Proteine aus Spinat- und Arabidopsis-Pflanzen durch verschiedene proteinbiochemische Methoden wie Ammoniumsulfat-Fällung und Säulenchromatographie aufgereinigt. Für den Nachweis ABA-bindender Proteine wurde als Detektionsverfahren ein nicht-kompetitiver ELISA etabliert. ABA-BSA-Konjugate wurden im ELISA als Sonden zum Nachweis ABA-bindender Proteine eingesetzt. Dazu wurde die Kopplung von ABA an BSA als Trägerprotein in dieser Arbeit durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, daß pro BSA-Molekül durchschnittlich 21 ABA-Moleküle gebunden wurden. Diese ABA-BSA-Konjugate wurden zur Immunisierung von zwei Kaninchen verwendet. Die gewonnenen polyklonalen Antikörper erwiesen sich als spezifisch gegenüber ABA. Aus Experimenten, bei denen die Konkurrenz von 3H-ABA und ABA um die Bindung an den Antikörper untersucht wurde, konnte ein Kd-Wert von 36,8 nM für den ABA/Antikörper-Komplex erhalten werden. Eine Aufreinigung von Proteinen aus Spinatpflanzen mittels Gelfiltrations-Chromatographie ergab keine spezifische ABA-BSA-Konjugat Bindung. Von den durch Aufreinigung von Arabidopsis-Proteinen mittels Kationenaustauscher-Chromatographie erhaltenen Fraktionen zeigten mehrere eine hohe ABA-BSA-Konjugat-Bindung. Bei der weiteren Aufreinigung einer dieser Fraktionen durch ABA-Affinitäts-Chromatographie wurden zwei ABA-bindende Proteine mit einem Molekulargewicht von 50 kDa und 52 kDa nachgewiesen.Goal of this work was to isolate abscisic acid binding proteins of spinach and Arabidopsis plants. Therefore the use of different proteinbiochemic methods like ammoniumsulfate-precipitation and chromatography principles were necessary. For the detection of abscisic acid binding proteins a none competitive ELISA was estabilsh. ABA-BSA-conjugates were used as linkers for the detection of ABA-binding proteins. Therefore a coppling reaction of ABA on BSA was estabilsh. One BSA-molecule binds about 21 ABA-moleclues. The immunisation with these conjugates of two rabbits leds to specific antibodys against ABA. The Kd-constant was 36.8 nM, measured with 3H-ABA. Spinach proteins isolated by gel chromatography showed no spezific binding of ABA-BSA-conjugates. The protein-extracts of Arabidopsis separated by ion exchange chromatography led to high ABA-BSA-conjugate binding in some fractions. One of these fraction war purified with ABA-affinity-chromatography. In the end two Proteins with an molecular weight of 50 and 52 kDa were purified