Mechanismus der mRNA Lokalisation in Xenopus Oozyten

Der gerichtete Transport spezifischer mRNAs ist ein Mechanismus zur Herstellung von Asymmetrie, welche eine wichtige biologische Rolle spielt. In Xenopus Oozyten ist die Lokalisierung von mRNA zum vegetativen Kortex sowohl für die Bildung der Keimblätter als auch die Entwicklung der Keimzellen bedeutsam. Mittels einer biochemischen Aufreinigungsstrategie, die auf der Anreicherung von RNPs aufgrund ihrer Größe basiert, wurden Xenopus Elr-Proteine, Homologe der Hu/ELAV-Proteinfamilie, welche in vier Isoformen vorliegen, als Komponenten der vegetativen mRNA-Lokalisationsmaschinerie identifiziert.Diese Proteine binden spezifisch an die Lokalisationselemente verschiedener Xenopus mRNAs aller drei Lokalisationswege. Außerdem sind sie gemeinsam mit anderen Lokalisationsproteinen, wie Vg1RBP, XStaufen1, VgRBP60 und 40LoVe Teil eines Ribonukleoprotein-Partikels (RNP). Immunopräzipitierte ElrA/B-RNPs enthalten andere interessante, neue Komponenten lokalisierter RNPs, wie z.B. RAP42/46, XhermesR und SLBP2. Zusätzlich wurden maternale mRNA-maskierende Proteine, nämlich FRGY2a/b und Xp54 identifiziert. Dies deutet auf eine Maskierung lokalisierter mRNAs hin.Elr-Proteine binden stark an die lokalisierende XDead End (XDE)-mRNA. Die Blockierung dieser Bindung durch Mutagenese des Lokalisationselementes oder durch maskierende antisense Morpholino-Oligonukleotide inhibiert die vegetative Lokalisierung dieser mRNA in Xenopus Oozyten. ElrA/B-Proteine liegen hauptsächlich zytoplasmatisch vor, wobei ElrA auch schwach im Nukleus lokalisiert ist. Möglicherweise wird es bereits im Kern Teil des RNPs. Ebenso wie andere bekannte Lokalisationsproteine sind ElrA/B außerdem am vegetativen Kortex angereichert.Weiterhin wurde festgestellt, dass ElrA/B-Proteine die Translation in Xenopus Oozyten leicht aktivieren, wenn sie an die 3 UTR einer Reporter rekrutiert werden. Vergleicht man allerdings die Translationsrate von Reporter-mRNAs, welche das ElrA/B-bindende XDE LE enthalten, mit Reportern, in denen die Bindung durch Mutationen blockiert ist, kann kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Weitere Analysen zeigten außerdem, dass die Bindung von ElrA/B an das XDE LE hat keinen signifikanten Einfluß auf die mRNA-Stabilität in der Oozyte. Allerdings zeigen die mutierten XDE LE-Fragmente eine verringerte Stabilität in den primordialen Keinzellen.Directional transport of specific mRNAs is a mechanism for the generation of asymmetry which is of primary biological importance. In Xenopus oocytes, mRNA localization to the vegetal cortex is important for germ layer formation and germ cell development. Using a biochemical purification approach for enriching localizing RNPs based on their large size, Xenopus Elr-type proteins which are in 4 isoforms, homologs of the Hu/ELAV proteins, were identified as novel components of the vegetal mRNA localization machinery.They bind specifically to the localization elements of several different vegetally localizing Xenopus mRNAs of all three localization pathways and they are part of one RNP together with other localization proteins, such as Vg1RBP, XStaufen1, VgRBP60 and 40LoVe. Immuno-isolated ElrA/B RNPs reveal other interesting, novel components of the localizing RNPs, such as RAP42/46, XhermesR and SLBP2. In addition maternal mRNA masking proteins, namely FRGY2a/b and Xp54 were also identified implying that localized mRNAs may also be masked.Blocking of Elr-type protein binding by either localization element mutagenesis or antisense morpholino oligonucleotides mediated masking of their target RNA sequences inhibits vegetal localization in Xenopus oocytes. ElrA/B proteins are predominantly cytoplasmic, with ElrA showing weak expression in the nucleus but perhaps joining the RNP complex in the nucleus. ElrA/B is also enriched at the vegetal cortex, a feature found to be similarly exhibited by the various localization proteins identified.ElrA/B proteins were found to moderately upregulate translation, when tethered to the 3 UTR of a reporter mRNA in the oocytes, whilst XDE LE with mutations blocking ElrA/B binding has no significant alteration of translation. Analysis also shows ElrA/B binding to XDE LE has no significant effect on mRNA stability in the oocyte; however in the embryo, the mutant versions of XDE LE show reduce stability in PGCs compared to the wild type