Investigations of Association of Genetic Polymorphisms in the CD14 Endotoxin Receptor Gene with Transcriptional Activity

Assoziationen des SNPs rs2569190 im CD14-Endotoxinrezeptorgen mit dem Risiko für verschiedene Erkrankungen, die mit einer Entzündungskomponente einhergehen, und weitere in-vitro-Experimente mit transfizierten Zelllinien lassen vermuten, dass das T-Allel der polymorphen Position über eine erhöhte transkriptionelle Aktivität CD14-exprimierende Zellen für endogenes oder exogenes LPS sensibilisiert. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Assoziation des SNPs mit der CD14-Genexpressionsrate in frisch isoliertem humanen Material ex vivo zu überprüfen. Als Parameter für die transkriptionelle Aktivität des CD14-Gens wurden die CD14-mRNA-Menge in PBMC und die sCD14-Serumkonzentration herangezogen. Als Ausgangsmaterial dienten Blutproben von 42 gesunden Probanden und 42 Patienten mit chronischer Hepatitis C. Des Weiteren standen Lebergewebeproben von 41 chronisch HCV-infizierten Patienten zur Verfügung. Mithilfe der Technik ASTQ (Allel-spezifische Transkriptqua! ntifizierung) sollte herausgefunden werden, ob das CD14-Gen in Bezug auf den SNP rs2569190 Allel-spezifisch exprimiert wird (allelische Imbalanz). Obwohl T-homozygote Personen im Mittel höhere sCD14-Konzentration im Serum aufweisen, unterscheiden sich die CD14-Expression in PBMC und Leberproben als auch die sCD14-Konzentration im Serum unter den rs2569190-Genotypgruppen nicht signifikant, weder bei Gesunden noch bei Patienten mit chronischer Hepatitis C. Auf der Suche nach einem ggf. anderen, mit in-vivo-CD14-Expressionsparametern assoziierten SNP, wurden weitere SNPs im CD14-Gen mit relevanter Heterozygotie auf die Assoziation geprüft. Zunächst die signifikante Assoziation, die jedoch nach der Bonferroni-Anpassung ihre Signifikanz verlor, umfasste bei gesunden rs5744455-T-Allelträgern niedrigere sCD14-Serumkonzentrationen im Vergleich zu C-Homozygoten und bei ebenso gesunden rs2563298-T-Allelträgern erhöhte sCD14-Werte im Vergleich zu G-Homozygoten. Was die allelisch! e Expression des CD14-Gens angeht, so sind in PBMC von Gesunde! n zum gr ößten Teil nur geringe Unterschiede in der Menge der allelischen Transkriptvarianten zu beobachten (bis ± 10 %). In PBMC von rs2569190-heterozygoten Patienten mit chronischer Hepatitis C ist die allelische Expression stärker ausgeprägt und zwar zugunsten des T-Allels, aber eine gewisse allelische Imbalanz ist auch in entsprechenden rs2569190-homozygoten Kontrollen zu sehen. In Leberproben von denselben heterozygoten Patienten überwiegt mal die eine und mal die andere Alleltranskriptvariante. Die Ergebnisse liefern also zwar Hinweise auf eine allelische Imbalanz in der Expression des CD14-Gens in vivo, sie stützen aber nicht die Annahme, dass allein das T-Allel des SNPs rs2569190 eine stärkere transkriptionelle Aktivität vermittelt. Die Allel-spezifische Expression lässt sich auch nicht auf eines der Allele an den 3 anderen untersuchten polymorphen Positionen (rs5744455, rs4914, rs2563298) zurückführen. Möglicherweise wird eine allelische Imbalanz nicht nur von d! en untersuchten SNPs bestimmt, sondern auch von anderen, nicht-genetischen Faktoren. Dies würde einerseits die Eindeutigkeit der Zuordnung des T-Allels mit einer stärkeren transkriptionellen Aktivität bei zellbiologischen Experimenten mit transfizierten Zelllinien (die unter standardisierten Bedingungen durchgeführt werden) und andererseits die Unterschiede bei ex vivo gewonnenem Material erklären.Association of the polymorphism rs2569190 within the CD14 endotoxin receptor gene with various disease conditions containing an inflammatory component and further in vitro experiments with transfected cell lines suggest that the T allele of the polymorphic position sensitizes the CD14 expressing cells to the exogenous and endogenous LPS (lipopolysaccharide) via an enhanced transcriptional activity. The aim of our work was to examine the association of this single nucleotide polymorphism with the CD14 gene exrpession rate in freshly isolated human material ex vivo. As parameters for the transcriptional activity of the CD14 gene, CD14 mRNA amount in PBMC and sCD14 concentration in serum were used. As a starting material served the blood samples of 42 healthy subjects and of 42 patients with chronic hepatitis C. Furthermore, the liver samples of 41 chronically HCV infected patients were available. Through the method of ASTQ (allele-specific transcript quantification) should be! found out whether the CD14 gene is expressed allele-specifically with regard to the SNP rs2569190 (allelic imbalance). Although the T homozygous subjects show on avarage a higher sCD14 concentration in serum, the CD14 expression in PBMC and liver samples as well as sCD14 concentration in serum differ not significantly among the rs2569190 genotype groups, neither in healthy subject nor in patients with chronic hepatitis C. Searching for an another SNP which might be associated with CD14 expression parameters in vivo, we checked other SNPs in CD14 gene with a relevant heterozygosity with regard to the association. We found some associations being initially significant, but losing their significance after Bonferroni correction: healthy carriers of the rs5744455 T allele have lower sCD14 concentration in serum in comparison with C homozygous subjects and as well healthy carriers of the rs2563298 T allele have higher sCD14 values compared with the G homozygous subjects. Regard! ing to an allelic expression of the CD14 gene, we observed mos! tly only minor differences in the amount of the allelic transcript variants (up to ± 10%). In PBMC of the rs2569190 heterozygous patients with chronic hepatitis C allelic expression is more pronounced and namely in favour of the T allele, but a certain allelic imbalance is to be observed also in corresponding rs2569190 homozygous controls. In the liver samples of the same heterozygous patients we found different predominance of allelic transcript variants in different cases. Thus, our results deliver an evidence for an allelic imbalance in CD14 gene expression in vivo, but they do not support the assumption that solely the T allele of the SNP rs2569190 mediate a stronger transcriptional activity. The allele-spesific expression is also not to be attributed to the either alleles of the 3 further investigated polymorphic positions (rs5744455, rs4914, rs2563298). Possibly an allelic imbalance is not determined only by the SNPs investigated, but also by another, non-genetical factors. ! This would explain the discrepancy between the unequivocal assignment of the T allele to a stronger trancriptional activity in experiments with transfected cell lines (which are carried out in standartised conditions) and inconsistent results in ex vivo obtained material