Effects of myelin phagocytosis on macrophages and microglia in vitro: Suppression of inflammatory activity and induction of apoptosis

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine der häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen, die im jungen und mittleren Alter zur Behinderung führt und erweckt dadurch schon seit längerem das medizinische Forschungsinteresse. Die Zerstörung der periaxonalen Myelinscheiden im ZNS ist das Hauptcharakteristikum der MS-Pathophysiologie. Die Entzündungsherde werden durch zahlreiche Makrophagen und residente Mikroglia infiltriert, die als Exekutoren der Myelinphagozytose und somit der MS-Pathologie fungieren. Ob die Rolle der mononukleären Phagozyten in der Potenzierung oder in der Eindämmung der neuroinflammatorischen Prozesse beruht, wird kontrovers diskutiert: Freund oder Feind?Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der Myelinphagozytose durch Makrophagen und Mikroglia in vitro und deren Auswirkung auf die inflammatorische Aktivität und die Vitalität dieser Effektorzellen. Mit unseren Ergebnissen möchten wir zur Klärung der kontrovers diskutierten Rolle dieser Schlüsselzellen im Rahmen der MS-Pathologie beitragen.In einem in-vitro-Modell inkubierten wir Peritonealmakrophagen und primäre Mikroglia mit Myelinfragmenten aus dem murinen Zentralen Nervensystem. Wir konnten zeigen, dass Myelinpartikel von Makrophagen und Mikroglia suffizient phagozytiert und in Phagolysosomen aktiv abgebaut werden. Die Myelinaufnahme in die Zellen erfolgt proportional zur Inkubationszeit und erreicht das Maximum nach 6 Stunden. Die mononukleären Phagozyten ändern dabei ihre Morphologie zu Schaumzellen.Die Untersuchungen der inflammatorischen Aktivität von Mikroglia fokussierten wir auf die Sekretion proinflammatorischer Zytokine TNFα und IP-10. Mikrogliazellkulturen wurden mit IFNγ prä-aktiviert. Eine Inkubation mit Myelin in Zeiträumen bis zu 48 Stunden ergab eine passagere Erhöhung der Zytokinsekretion in der frühen Phase (bis 6h) und nachfolgend eine kontinuierliche Suppression der Zytokinfreisetzung (6-48h). Eine prä-Aktivierung der Zellkulturen mit LPS und IFNγ verdeutlichte die suppressive Wirkung der Myelinphagozytose auf die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen TNFα und IP-10.Die Auswirkungen der Myelinphagozytose auf die Zellvitalität konnten wir durch Indikatoren des nekrotischen und apoptotischen Zelluntergangs erfassen. In dem MTT-Proliferationsassay zeigte sich eine übermäßige Vitalität (bis zu 250%) der Myelin-behandelten Phagozyten gegenüber der unbehandelten Kontrolle (100%). Hinter diesem Ergebnis vermuten wir einen wichtigen Artefakt, der auf den oxidativen Stress der Zellen im Rahmen der Myelinphagozytose hindeutet. Durch die Messung der Caspasenaktivität 3/7 und des mitochondrialen Membranpotentials ΔΨ in den Myelin-behandelten Makrophagen ist es uns gelungen einen apoptotischen Zelluntergang Myelin-behandelter Makrophagen nachzuweisen.Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Phagozytose von Myelin durch mononukleäre Phagozyten zur Suppression der inflammatorischen Zytokine TNFα und IP-10 und zur Induktion eines apoptotischen Zelluntergangs führen kann. Damit ergibt sich ein Hinweis dafür, dass die Rolle der mononukleären Phagozyten im Rahmen der MS-Pathologie eher in der Suppression des neuroinflammatorischen Geschehens beruhen könnte. Die zeitlichen Remissionen der Symptomatik und der selbstlimitierende Charakter der schubförmigen MS könnten das klinische Korrelat darstellen.Multiple Sclerosis (MS) is one of the most common neurodegenerative disorders causing disability in young and middle-aged patients and therefore has been arousing the interest of medical research for a long time. A destruction of periaxonal myelin sheaths in the CNS is the main characteristic of the MS-pathophysiology. Active MS-lesions are infiltrated by numerous macrophages and resident microglia, which are the executors of the myelin phagocytosis and herewith the executors of the MS-pathology. Whether mononuclear phagocytes play a role in the amplification or in the suppression of neuroinflammatory processes, is highly debated: friend or foe?The aim of this work is the study of myelin phagocytosis by macrophages and microglia in vitro and its effects on the inflammatory activity and the vitality of these effector cells. With our results we would like to clarify the controversial role of these key cells in the context of MS pathology.In an in vitro model we incubated peritoneal macrophages and primary microglia with myelin fragments from the murine central nervous system. We have shown that myelin particles are sufficiently internalized via phagocytosis by macrophages and microglia and are actively digested in phagolysosomes.The myelin intake is proportional to the incubation time and reaches its maximum after 6 hours. In this process mononuclear phagocytes change their morphology to foam cells.We focused our investigations of proinflammatory activity of microglia on the secretion of proinflammatory cytokines like TNFα and IP-10. Microglia cell cultures were pre-activated by IFNγ. An incubation with myelin in periods of up to 48 hours revealed a temporary increase in the early phase (up to 6h) and subsequently a continuous suppression of the cytokine secretion (6-48h).A pre-activation of cell cultures with LPS and IFNγ demonstrated the suppressive effect of myelin phagocytosis on the release of proinflammatory cytokines TNFα and IP-10.We demonstrated the effect of myelin phagocytosis on the cell vitality by indicators for necrotic and apoptotic cell death. The MTT-proliferation assay resulted in an excessive vitality (up to 250%) of myelin-treated phagocytes against the untreated control (100%). Behind this results we suggest an important artifact, which may be based on the oxidative stress of cells caused by myelin phagocytosis.By measuring the caspase-3/7-activity and the mitochondrial membrane potential ΔΨ we demonstrated an apoptotic cell death of the myelin-treated macrophages.Our results show that the phagocytosis of myelin by mononuclear phagocytes may result in suppression of inflammatory cytokines like TNFα and IP-10 and may induce an apoptotic cell death in this cells.In the context of MS, our results indicate, that mononuclear phagocytes may play a role in the suppression of the neuroinflammatory process. The clinical correlation could be represented by symptom-remission in time and the self-limiting nature of this disease