Funktionelle Analyse von Isoformen der CAPS-Proteinfamilie

Endokrine, neuronale und exokrine Zellen verfügen über einen regulierten Sekretionsweg, durch welchen Hormone, Neurotransmitter und Enzyme kontrolliert freigesetzt werden können. Dieser kontrollierte Exozytosevorgang benötigt neben Kalziumionen auch ATP und zelleigene Schlüsselmoleküle, welche die Freisetzung vermitteln und regulieren. CAPS ist ein solches Protein, welches als putativer Regulator der Transmittersekretion aus PC12-Zellen identifiziert wurde. Neben der Pleckstrin-homologen Domäne besitzt CAPS (145 kDa) eine Domäne mit Homologie zu dem Primingfaktor Munc13-1 (MHD1). Es ist ein Ortholog von Unc-31, einem Genprodukt aus Caenorhabditis elegans, das im Nematoden multiple Funktionen des Nervensystems beeinflusst. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die funktionelle Bedeutung von CAPS bei der Exozytose zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden in Mammaliern exprimierte CAPS-Isoformen identifiziert und einer vergleichenden Analyse ihrer Expression und subzellulären Verteilung unterzogen sowie ihre Rolle in zentralnervösen und neuroendokrinen Geweben charakterisiert. Ausserdem wurden für weitere funktionelle Studien CAPS-deletionsmutante Mäuse hergestellt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Familie der CAPS-Proteine in Säugern aus zwei Mitgliedern besteht, CAPS1 und CAPS2. CAPS1 wird in fast allen Neuronen des zentralen Nervensystems und darüber hinaus nur noch in neuroendokrinen Geweben wie dem Gehirn, dem Pankreas und der Nebenniere exprimiert. Die CAPS2-Expression ist demgegenüber im Gehirn weniger homogen, jedoch auch in einer Reihe nichtneuronaler Gewebe detektierbar. CAPS1, die im zentralen Nervensystem bei weitem abundanteste CAPS-Isoform, ist spezifisch in präsynaptischen Kompartimenten des synaptischen Neuropils lokalisiert und in der Körnerzellschicht des Cerebellums auf exzitatorische Synapsen beschränkt. Eine funktionelle Analyse von CAPS1-deletionsmutanten Mäusen zeigt, dass CAPS1 ein zum Überleben essentielles Protein ist. CAPS1-defiziente Mäuse sterben kurz nach der Geburt, weisen jedoch weder im Gehirn noch in der Nebenniere morphologische Auffälligkeiten auf. Während dies bedeutet, dass CAPS1 für die Entwicklung und strukturelle Integrität dieser Gewebe keine Bedeutung hat, zeigen elektrophysiologische Untersuchungen an chromaffinen Zellen der Nebenniere, dass der teilweise Verlust von CAPS1 in adulten heterozygoten deletionsmutanten Tieren zu einem deutlichen Sekretionsdefizit führt. Dieses Defizit ist auf eine Herabsetzung der akut freisetzbaren Pools sekretorischer Granula zurückzuführen und zeigt, dass CAPS1, wie das strukturverwandte Munc13-1 am priming sekretorischer Vesikel beteiligt ist. Überraschenderweise ist ein solcher Phänotyp in chromaffinen Zellen aus Nebennieren neugeborener homozygoter CAPS1-Deletionsmutanten nicht nachweisbar. Die vorliegende Studie erlaubt den Schluss, dass CAPS1 das priming von LDCVs in chromaffinen Zellen reguliert. Eine weitere hochinteressante Folgerung der morphologischen Analyse der CAPS1-Verteilung im Gehirn ist, dass CAPS-Proteine auch an der Freisetzung klassischer Neurotransmitter aus synaptischen Vesikeln beteiligt sein könnten.Endocrine, neural and exocrine cells posses a regulatory secretion pathway by which hormones, neurotranmittes and enzymes are released. This exocytosis process requires calcium, ATP and additionally key molecules which mediate and regulate the release. CAPS is such a protein of 145 kDa which was identified as a putative regulator for transmitter secretion in PC12 cells. It consists of a pleckstrin homology domain and a domain (MHD1) with homology to the priming factor Munc13-1. CAPS is an ortholog of Unc-31, a gene product in the nematode Caenorhabditis elegans where it affects multiple functions of the nervous system. The aim of this thesis was to analyse the functional role of CAPS during exocytosis. For this purpose in mammalia expressed CAPS isoforms were identified. The expression and subcellular distribution was analysed in a comparative manner and its role in central nervous and neuroendocrine tissue were characterised. In addition CAPS1-deficient mice were generated. This thesis indicates that the familiy of the CAPS proteins in mammalia consists of two members, CAPS1 and CAPS2. CAPS1 is expressed in almost all neurons of the central nervous system and additionally in neuroendocrine tissues such as brain, pancreas and adrenal gland. The expression of CAPS2 in brain is less homogenously distributed but on the other hand also in non-neuronal tissue detectable. CAPS1, the most abundant isoform in brain, is specifically localised in presynaptic components of the synaptic neuropil. It is restricted to excitatory synapses only in the granule layer of the cerebellum. The functional analysis of CAPS1-deficient mice indicates its essential role for survival. CAPS1 deficient mice die within short time after delivery of birth. They do not show deficits in structure of brain and adrenal gland. This means that CAPS is not essential for development and structural integrity of those tissues. Instead electrophysiological analyses of chromaffine cells in adrenal slices of heterozygous adult mice indicate that a partial loss of CAPS1 leads to a significant reduction in secretion. This deficit is induced by a reduction of the readily releasable pool of secretory granules. It indicates that CAPS1 is responsible for priming of secretory vesicles as does the structural similar Munc13-1. Suprisingly this phenomen of reduced secretion is not detectable in chromaffine cells in adrenal slices of CAPS1-deficient newborn mice. The described analyses indicate the essential role of CAPS1 for priming of large dense-core vesicles in chromaffine cell. In addition its distribution in brain implicate a putative role for release of classical neurotransmitters of synaptic vesicles