Analyse des wahren Zeitverlaufs der Neurotransmitterfreisetzung aus SSVs und LDCVs; Analyse der SNARE-Funktion in Synaptobrevin2- und Cellubrevin-defizienten Mäusen

Teil 1Die Freisetzung von Neurotransmittern wird durch die Ca2+-abhängige Exocytose von synaptischen Vesikeln vermittelt, die eine sehr schnelle Kinetik der Transmitterfreisetzung aufweist. Mit Hilfe von Kohlefasern als elektrochemische Detektoren wurde die Freisetzung des Neurotransmitters Serotonin aus kultivierten Retzius-Zellen der Blutegel (Hirudo medicinalis) gemessen. Die Kinetik der amperometrischen Signale gibt den Zeitverlauf der Transmitterfreisetzung und der Diffusion der Moleküle vom Ort der Freisetzung bis zum Detektor wieder. Darauf aufbauend wurde eine explizite Formel, HWDextran = (HWRinger-HWreal) · DRinger/DDextrant + HWreal (wobei HW der halben Breite eines einzelnen amperometrischen Spikes, und D dem Diffusionskoeffizienten der Transmittermoleküle entspricht), abgeleitet, um den realen Zeitverlauf (HW) der Transmitterfreisetzung von SSVs (small synaptic vesicles) und LDCVs (large dense core vesicles) zu berechnen. Dies erfolgte unter Verwendung von Dextran-Molekülen (40000 Da), die den Diffusionskoeffizienten verändern. Der reale Zeitverlauf (Hwreal) der Transmitterfreisetzung aus SSVs liegt bei 198 ms und der Beitrag der Diffusion an der Verbreiterung der Kinetik von individuellen amperometrischen Signalen von SSVs beträgt etwa 20%.Diese Ergebnisse deuten darauf, daß die exocytotische Freisetzung von SSVs nicht spontan erfolgt und daß die Mehrheit der Kinetik von einzelnen amperometrischen Signalen der SSVs hauptsächlich vom realen Zeitverlauf der Transmitterfreisetzung abhängig ist. Der reale Zeitverlauf (Hwreal) der Freisetzung von LDCVs wurde ebenfalls bestimmt und liegt bei etwa 1133 ms. Zudem wurde der Einfluß der Temperatur auf den Freisetzungsprozeß von SSVs ebenfalls untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß mit zunehmender Temperatur die Kinetik der Freisetzung um einen Q10-Wert von 1.77 beschleunigt wurde und zu einer dramatischen Zunahme der Freisetzungsfrequenz um einen Q10-Wert von 6.0 führen kann. Der für den Temperatureffekt auf die Kinetik der amperometrischen Ereignisse verantwortliche, zugrunde liegende Mechanismus kann durch ein in dieser Studie entwickeltes Modell anschaulich interpretiert werden. Es wird angenommen, daß die Größe der Fusionspore sich in zwei Schritten ändert: einem initialen Öffnen der Fusionspore, die sehr schnell, und einer nachfolgenden Expansion dieser Pore, die relativ langsam verläuft. Der erste Schritt dominiert hauptsächlich die Kinetik des Freisetzungsprozesses, während der zweite Schritt der Fusionsporenvergrößerung weniger zu dieser Kinetik beiträgt. Verglichen mit dem ersten Schritt ist die Phase der Porenexpansion empfindlicher gegenüber Temperaturveränderungen, womit die letztendliche Veränderung der Kinetik um nur 1.77fach bei einer Temperaturveränderung um 10 Grad erklärt werden kann.Teil 2SNAREs (soluble NSF-attachment protein receptors) werden generell als zentrale Komponenten des Membranfusionsprozesses angesehen. Während einer Fusion bilden SNAREs (der Vesikel SNARE Synaptobrevin, der SNARE Syntaxin der Plasmamembran und SNAP-25) über ihre SNARE-Motive Komplexe. Obwohl SNAREs intensiv untersucht wurden, ist ihre präzise Rolle im Prozess der Membranfusion unklar. In dieser Studie wurde die Exocytose in den chromaffinen Zellen von Synaptobrevin2 (syb2)- und Cellubrevin (VAMP3, einem Mitglied der Synaptobrevin/VAMP Familie der SNAREs)-defizienten Mäuse untersucht.In Abwesenheit von syb2 bleibt die Exocytose weiter bestehen, jedoch ist die Freisetzungsfreuquenz um 20% verringert. Einzelne versikuläre Fusionsprozesse zeigten normale Charakteristiken der Spikephase, die Dauer des Grundsignals beträgt jedoch das Zweifache im Vergleich zum Wildtyp. Durch die Expression der leichten Kette von TeNT in syb2-/- chromaffinen Zellen wurde die restliche Freisetzung vollständig blockiert. Die verlängerte Dauer des Grundsignals und die verringerte Freisetzungsfrequenz wurden durch die Überexpression des syb2-Proteins vollständig auf den Wildtyp-Zustand rekonvertiert. Jedoch zeigte die Überexpression von Cellubrevin (VAMP3) in syb2-/--Zellen einen gegenteiligen Effekt auf die Dauer des Grundsignals, wobei exogenes VAMP3 diese im Vergleich zum Wildtyp sogar um das Dreifache verlängerte. Die Exocytose in VAMP3-/--Zellen wurde ebenfalls untersucht, wobei kein signfikanter Unterschied zwischen den mutanten Zellen und der Kontrolle in Hinsicht auf die Sekretion und den individuellen Fusionsprozess gefunden wurde. Wir schließen daraus, daß Synaptobrevin-Proteine die Exocytose unterstützen und daß sie funktionell redundant sind. Beide Synaptobrevin-Isoformen (syb2 und VAMP3) sind am Prozess der Fuionsporen-Expansion beteiligt, jedoch üben sie gegensätzliche Effekte in diesem Zustand aus.Part 1Neurotransmitter release is mediated by Ca2+ dependent exocytosis of synaptic vesicles. The release process has very rapid kinetics. Using carbon fibers as electrochemical detectors, the release of the neurotransmitter serotonin was measured from cultured Retzius cells of the leech (Hirudo medicinalis). The kinetics of amperometric signals reflects the time course of transmitter release and the diffusion of molecules from the release site to the detector. Based on this, an explicit formula, HWDextran = (HWRinger-HWreal) × DRinger/DDextrant + HWreal (here, HW is the half-width of individual amperometric spike, and D is the diffusion coefficient of transmitter molecules) was developped to calculate the real time course (HW) of transmitter release of SSVs (small synaptic vesicles) and LDCVs (large dense core vesicles), by introducing Dextran molecules (40,000 Da) to change the diffusion coefficient. The real time course (HWreal) of transmitter release of SSVs is about 198 ms and the contribution of diffusional broadening on the kinetics of individual amperometric signals of SSVs is about 20 %.These results indicate that exocytotic release of SSVs is non-instantaneous and the majority of the kinetics of individual amperometric signals of SSVs is dominated by real time course of transmitter release. The real time course (HWreal) of the release process of LDCVs was also determined (about 1133 ms). Furthermore, the temperature effects on the release process of SSVs were also investigated. The results show that increasing temperature can accelerate the release kinetics by a Q10 value of 1.77 and leads to a dramatic increase of release frequency by a Q10 value of 6.0. In the end, the underlying mechanism responsible for the temperature effects on the kinetics of amperometric events can be well interpreted by a model developed in this study. It is proposed that, the fusion pore size changes in two steps, the initial opening of the fusion pore which is very rapid, and afterwards the expansion of the pore which is relatively slow. The first step dominates the kinetics of release process, in contrast, the second step of fusion pore dilation contributes less to the kinetics. Compared the first step, the dilation phase is more sensitive to temperature changes, which can explain that the final change of kinetics is only 1.77 fold for temperature change of 10 oC.Part 2SNAREs (soluble NSF-attachment protein receptors) are generally acknowledged as central components of membrane fusion reactions. During fusion, SNAREs (the vesicle SNARE synaptobrevin and the plasma membrane SNAREs syntaxin 1 and SNAP-25) form complexes through their SNARE motifs. Although SNAREs have been studied in great detail, their precise role in membrane fusion has remained unclear. In this study, the exocytosis in the chromaffin cells from synaptobrevin2 (syb2) and cellubrevin (VAMP3, one member of the synaptobrevin / VAMP family of SNAREs) null mice was examined.In the absence of syb2, exocytosis persisted, but the release frequency was decreased by 20 %. Single vesicular fusion events showed normal characteristics of spike phase, but the duration of foot signal was prolonged by two-fold compared to wild type. Expression of TeNT light chain in syb2-/- chromaffin cells completely abolished the residual release. The prolonged foot duration and the decreased release frequency were fully rescued to wild type level by over-expressing syb2 protein. However, over-expression of cellubrevin (VAMP3) in syb2-/- cells had an opposite effect on the foot duration, that exogenous VAMP3 even prolonged the foot duration by 3-fold compared to wild type. The exocytosis in VAMP3-/- chromaffin cells was also examined, no significant differences were found between mutant and control cells, with respect to secretion and individual fusion events. It is concluded that synaptobrevin proteins support exocytosis, and they are functionally redundant. Both synaptobrevin isoforms (syb2 and VAMP3) are involved in the stage of fusion pore dilation, but they have opposite effects on this stage