Strukturelle Charakterisierung der zwei Kupferproteine Distickstoffoxidreduktase aus Pseudomonas stutzeri und Laccase Lcc5 aus Coprinopsis cinerea

Obwohl die Reduktion von Distickstoffoxid (N2O) stark exergonisch ist, verhindert eine hohe Aktivierungsenergie eine spontane Reaktion. Wie Distickstoff benötigt N2O ein komplexes Metallzentrum, um aktiviert zu werden. Das einzige bekannte Enzym, welches die Reduktion von N2O zu N2 katalysieren kann, ist das sauerstoffempfindliche Protein Distickstoffmonoxidreduktase (N2OR). Kristallographische Untersuchungen an diesem Protein aus Paracoccus denitrificans, Marinobacter hydrocarbonoclasticus und Achromobacter cycloclastes ermöglichten Einblicke in dessen Struktur: Das Protein formt ein "Head-to-Tail"-Dimer, dessen Bildung notwendig für die enzymatische Reaktion ist. Jedes Monomer besteht aus zwei separaten Domänen, einem N-terminalen β-Propeller mit dem tetranuclear CuZ-Zentrum und einer C-terminalen Cupredoxin-ähnlichen Domäne, welche ein gemischt-valentes CuA-Zentrum trägt, ähnlich dem der Cytochrom c Oxidase. Diese N2O-Reduktasestrukturen repräsentieren jedoch aerob isoliertes Protein, welches nur aktiv ist, nach einer verlängerten Inkubation mit Reduktionsmitteln. Im Gegensatz hierzu zeigt die violette Form der Distickstoffoxidreduktase aus Pseudomonas stutzeri physiologische Aktivität, ohne dass eine vorherige reduktive Aktivierung notwendig ist. In dieser Arbeit wird sowohl die erste Kristallstruktur der physiologisch aktiven Form der N2O-Reduktase als auch die erste Struktur eines Metall-N2O-Komplexes beschrieben. Dies ermöglicht neue Erkenntnisse hinsichtlich des Bindungsmodus von N2O an das katalytische Zentrum. In mit N2O-begasten Kristallen bindet Distickstoffoxid zwischen dem CuA und dem CuZ-Zentrum. Das CuA-Zentrum ist wie bereits früher beschrieben ein gemischt-valentes Zentrum, welches zwischen dem oxidiertem [Cu+1.5:Cu+1.5] und dem reduziertem [Cu+:Cu+] Zustand alterniert und dadurch ein Elektron pro Zyklus zur Verfügung stellt. Im Gegensatz zu früheren Strukturen ist der Histidinligand von CuA1 flexibel und rotiert abhängig von der Anwesenheit des Substrats, um Wasserstoffbrücken zu einem nahegelegenem Serin- und Aspartatrest zu bilden. Desweiteren zeigt das CuZ einen entscheidenden strukturellen Unterschied zu früheren Beschreibungen. An der Kante von CuZ1 und CuZ4 befindet sich anstelle des beschriebenen Wassermoleküls ein zweiter Schwefel. Dieser ermöglicht die Erklärung verschiedener spektroskopischer Beobachtungen bei den einzelnen Enzymformen. CuZ der violetten Distickstoffoxidreduktase aus Pseudomonas stutzeri ist daher ein [4Cu:2S] Zentrum, wohingegen das [4Cu:1S] Cluster, welches zuvor bei anderen Formen beobachtet wurde, das CuZ* Zentrum repräsentiert. Der zweite Schwefel stabilisiert vermutlich die Geometrie von CuZ und könnte daher Voraussetzung für eine erfolgreiche Substratbindung darstellen. Der Bindungsmodus von N2O deutet an, dass CuZ und CuA als ein aktives Zentrum fungieren, um das Substrat zu reduzieren.Although, the reduction of nitrous oxide (N2O) is highly exergonic, a high activation barrier hinders a spontaneous reaction. With regard to inertness, N2O is second only to molecular nitrogen and in both cases a complex metal center is required for activation. The only known enzyme, which catalyzes the reduction of N2O to N2 is the oxygen sensitive copper-protein nitrous oxide reductase (N2OR). Crystallographic studies on this enzyme from Paracoccus denitrificans, Marinobacter hydrocarbonoclasticus and Achromobacter cycloclastes provided insight into its structure: The protein forms a head-to-tail homodimer, which was shown to be obligatory for enzyme reaction. Each monomer comprises of two distinct domains, an N-terminal β-propeller with the tetranuclear CuZ site and a C-terminal cupredoxin-like domain carrying the mixed valent CuA center, similar to the one found in cytochrome c oxidase. However, these structures represent the aerobically isolated protein, which is only active upon extended incubation with reducing agents. In contrast, the purple form of nitrous oxide reductase from Pseudomonas stutzeri shows physiological activity without the necessity of reductive activation. This work presents the first structure of the purple form of nitrous oxide reductase and as well the first structure of a metal-N2O complex, providing new insights into the binding mode of N2O to the catalytic site. In pressurized crystals N2O binds between CuZ and CuA site, which is as previously described a mixed-valent center alternating between the oxidized mixed-valent [Cu+1.5:Cu+1.5] and the reduced [Cu+:Cu+] state thereby providing one electron per cycle. In contrast to previous structures, the histidine ligand of CuA1 is flexible and rotates to form hydrogen bonds with a near-by serine and aspartate residue in dependence of substrate binding. Additionally, a major structural difference could be observed for the CuZ site. A second sulfur ion is found at the edge of CuZ1 and CuZ4 replacing the earlier described water molecule. This observation offers an explanation for several spectroscopic features of the different enzyme forms. The CuZ of purple nitrous oxide reductase from Pseudomonas stutzeri is therefore a [4Cu:2S] site, whereas the [4Cu:1S] center observed in previously structures represents the CuZ* state. The second sulfur might stabilize the CuZ geometry by binding to CuZ1 and CuZ4, which might be a prerequisite for successful substrate binding. The observed binding mode of N2O indicates that both copper center act in concert to reduce the substrate