Functional characterization of apoplastic proteins of Brassica napus and Arabidopsis thaliana after infection with Verticillium longisporum

Verticillium longisporum ist ein bodenbürtiger, pathogener Pilz, der auf die Pflanzenfamilie der Brassicaceae spezialisiert ist. Da V. longisporum ein vaskuläres Pathogen ist, welches die meiste Zeit seines Lebenszyklus in der Pflanze im Xylem lokalisiert ist, werden Abwehrreaktionen der Pflanze im extrazellulären Raum erwartet. In einer vorangegangenen Arbeit wurde das extrazelluläre Proteom von Brassica napus und Arabidopsis thaliana im Hinblick auf Veränderungen infolge der Infektion der Pflanzen durch V. longisporum untersucht. Es zeigte sich, dass in B. napus eine Glucanase, eine Peroxidase, eine Chitinase sowie ein PR-4-Protein und in A. thaliana drei verschiedene Peroxidasen, eine Serin-Carboxypeptidase, eine α-Galactosidase und ein Germin-ähnliches Protein (GLP3) nach Infektion mit dem Pathogen vermehrt produziert wurden, während ein Lectin-ähnliches Protein in A. thaliana in geringeren Mengen auftrat. Ziel der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Charakterisierung dieser differenziell auftretenden extrazellulären Proteine in B. napus und A. thaliana nach einer Infektion durch V. longisporum in Relation zu physiologischen und anatomischen Veränderungen. Der Xylemsaft von B. napus wurde auf putative Abwehrsubstanzen hin überprüft, die sich auf das Wachstum von V. longisporum auswirken könnten. Zu diesem Zweck wurde das Wachstum des Pilzes in Xylemsaft aus infizierten und uninfizierten Pflanzen verglichen. Es zeigte sich eine deutliche Beeinträchtigung des Wachstums von V. longisporum im Xylemsaft von infizierten Pflanzen. Diese Inhibierung konnte nicht auf eine mangelnde Nährstoffverfügbarkeit im Xylemsaft zurückgeführt werden. Auch Salizylsäure, welche im Xylemsaft von B. napus infolge einer Infektion in erhöhten Mengen vorkommt, hatte keinen direkten Einfluss auf das Pilzwachstum. Mit Hilfe weiterer Wachstumsversuche im Xylemsaft und einem Vollnährmedium konnte nachgewiesen werden, dass die im Xylemsaft enthaltenen Proteine die Proliferation von V. longisporum massiv inhibieren. Diese antifungale Eigenschaft konnte sowohl für die Proteine aus dem Xylemsaft von infizierten Pflanzen als auch für die aus dem Xylemsaft aus nicht infizierten Pflanzen gezeigt werden. Die Pflanze sekretiert also konstitutiv Proteine mit einer antifungalen Wirkungsweise in den Apoplast, wodurch sie einer unkontrollierten Ausbreitung von Mikroorganismen entgegenwirken kann. Da einige der in A. thaliana nach einer Verticillium-Infektion differentiell auftretenden Proteine mit Funktionen bei der Modifizierung und Umgestaltung der Zellwand assoziiert werden, wurden infizierte und nicht infizierte Pflanzen anatomisch untersucht und auf Unterschiede überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass eine Infektion mit V. longisporum in A. thaliana im Hypokotyl sowie in den Blättern zur Bildung von hyperplastischem Xylem und in den Blättern zusätzlich zu einer Transdifferenzierung von Mesophyllzellen zu Gefäßen führt. Die biologische Rolle dieser vermehrten Bildung neuer wasserleitender Elemente muss noch weiter untersucht werden. Um zu überprüfen, welche Proteine in A. thaliana an der Immunantwort gegen V. longisporum beteiligt sind, wurden funktionelle Analysen durchgeführt. Dazu wurden homozygote Pflanze von T-DNA-Insertionslinien isoliert und hinsichtlich einer veränderten Suszeptibilität gegenüber V. longisporum untersucht. Die meisten Linien besaßen einen ähnlichen Pathophänotyp wie der Wildtyp. Eine Linie mit einer reduzierten glp3-Expression reagierte jedoch mit einer erhöhten Suszeptibilität. Weitere Analysen mit amiRNA-Linien bestätigten diese Beobachtung. Pflanzen mit einer konstitutiv erhöhten glp3-Expression waren dagegen resistenter gegenüber V. longisporum. Zudem war die Pilzmenge in infizierten Überexpressionspflanzen deutlich geringer als in infizierten Wildtyp-Pflanzen. Um die spezifische Funktion von GLP3 innerhalb der Pflanze-Pathogen-Interaktion weiter zu charakterisieren, wurde überprüft, ob GLP3 V. longisporum direkt beeinflusst. Heterolog in Hefe produziertes GLP3 konnte das Wachstum von V. longisporum einschränken. GLP3 vermittelt in A. thaliana Resistenz gegenüber V. longisporum, indem es offenbar die Kolonisierung durch das Pathogen direkt minimiert. Der genaue molekulare Mechanismus ist bislang unklar und sollte in weiteren Experimenten untersucht werden.Verticillium longisporum is a soil-borne pathogenic fungus which is restricted to the family of Brassicaceae. V. longisporum is a vascular pathogen which colonizes the xylem of its host plants. Therefore, main defence reactions are expected in the extracellular matrix. Previously, the extracellular proteome of infected and mock inoculated Brassica napus and Arabidopsis thaliana plants was analysed and compared. In B. napus a glucanase, a peroxidase, a chitinase and a PR-4 protein were induced following infection. In A. thaliana three different peroxidases, a serine-carboxypeptidase, an α-galactosidase and a germin-like protein (GLP3) were more abundant after infection. In contrast, a lectin-like protein was downregulated. The aim of this study was to functionally characterize those differentially expressed extracellular proteins in B. napus and A. thaliana in relation to physiological and anatomical alterations. To test the hypothesis that defence related proteins in the xylem sap of B. napus could influence V. longisporum fungal proliferation was investigated in xylem sap of infected and mock inoculated plants. The growth of the fungus was restricted in xylem sap of infected plants compared to controls. This growth behaviour cannot be attributed to nutrient deficiencies in xylem sap of infected plants. Furthermore, the effect of salicylic acid on the growth of the fungus was studied. Salicylic acid was reported to increase after V. longisporum infection in the xylem sap of B. napus. But there was no effect on the proliferation of V. longisporum. In additional experiments the influence of xylem sap proteins on fungal growth was tested. Proliferation of V. longisporum was strongly enhanced in protein-free xylem sap regardless whether the sap was from infected or non-infected oil seed rape plants. These results show that the constitutive presence of defence proteins in xylem sap suppresses uncontrolled proliferation of V. longisporum. Since some of the differentially expressed candidate proteins in A. thaliana are suggested to play a role in cell wall remodelling and modifications infected and mock inoculated plants were investigated anatomically. Infection with V. longisporum led to the production of hyperplastic xylem in the hypocotyl as well as in leaves. Moreover, transdifferentiation of mesophyll cells into xylem vessels was observed in the leaves. The biological role of this observations remains unclear and needs to be investigated in future studies. To investigate which proteins are responsible for the immune response against V. longisporum in A. thaliana, functional analysis were performed. For this purpose, homozygous plants of T-DNA insertion lines were isolated and challenged with V. longisporum. Most of them displayed a similar pathophenotype like the wildtype. However, one line with a reduced expression of the germin-like protein 3 (GLP3) showed enhanced susceptibility to the fungus. Further experiments with amiRNA lines supported these results. Moreover, glp3-overexpressing plants with a constitutively higher glp3 transcript level were more resistant to V. longisporum. Also the amount of fungal DNA within the plants was significantly reduced in infected overexpressing plants compared to wildtype plants. The next step then was to characterize the function of GLP3 for the plant-pathogen interaction. Growth experiments with heterologous expressed GLP3 showed that the protein was able to attenuate proliferation of V.longisporum in vitro. The results indicate that GLP3 mediates resistance in A. thaliana by restricting the growth of the fungus directly. The molecular mechanisms of glp3 action is unclear and should be investigated in further experiments