The impact of the glutamate dehydrogenases on the link between carbon and nitrogen metabolism in Bacillus subtilis

Glutamat ist der zentrale Aminogruppendonor für alle stickstoffhaltigen Verbindungen in der Zelle. In dem Gram-positiven Bodenbakterium Bacillus subtilis wird Glutamat ausschließlich in den gekoppelten Reaktionen der Glutaminsynthetase und der Glutamatsynthase synthetisiert. Da für den Aufbau von Glutamat 2 Oxoglutarat aus dem Citrat Zyklus benötigt wird, stellt die Glutamatsynthese einen wichtigen Knotenpunkt zwischen dem Kohlenstoff- und Stickstoffstoffwechsel dar. Deshalb ist die Expression der beteiligten Enzyme streng reguliert. Der Abbau von Glutamat wird von der Glutamatdehydrogenase RocG katalysiert. Durch die geringe Affinität zu Ammonium kann dieses Enzym nicht die Synthese von Glutamat katalysieren. Neben der enzymatischen Funktion reguliert RocG die Aktivität des Transkriptionsregulators GltC, der bedeutend für die Expression der Glutamatsynthase ist. In dieser Arbeit wurden mutierte RocG-Varianten isoliert und charakterisiert. Durch einen Aminosäureaustausch wurden die beiden Funktion von RocG voneinander getrennt. Eine Klasse von Varianten inaktiviert GltC sehr stark und ist in ihrer zeigt enzymatischen Aktivität schwer beeinträchtigt. Die zweite Klasse kann GltC nicht mehr inhibieren, zeigt aber enzymatische Aktivität. Diese Ergebnisse geben einen Einblick in den regulatorischen Mechanismus der RocG-GltC Interaktion. B. subtilis 168 kodiert für eine zweite Glutamatdehydrogenase, GudB. Im Laborstamm 168 ist das gudB-Gen durch eine direkte Wiederholung von neun Basenpaaren kryptisch. Beim Wachstum einer rocG-Mutante auf Komplexmedium wird das gudB-Allel schnell dekryptifiziert, wobei immer eine Hälfte der Sequenzwiederholung deletiert wird. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die gudB-Mutation mit einer extrem hohen Rate von 10-4 auftritt. Außerdem wurde bewiesen, dass eine perfekte Basen-wiederholung für die hohe Mutationsrate notwendig ist. Darüber hinaus zeigte sich in einem artifiziellen Mutagenese-System, dass die Transkription für die hohe Mutationsrate des gudB-Gens notwendig ist. Das Mfd Protein, welches die Transkription mit der DNA Reparatur koppelt, spielt eine entscheidende Rolle bei der Dekryptifizierung des gudB Gens. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die herausragende Bedeutung der Glutamathomöostase in B. subtilis.Glutamate is the central amino group donor for all nitrogen containing compounds in the cell. In the Gram-positive soil-dwelling bacterium Bacillus subtilis glutamate is exclusively synthesized by the combined reactions of the glutamine synthetase and the glutamate synthase. Since the synthesis of glutamate requires 2-oxoglutarate that is derived from the tricarboxylic acid cycle, glutamate metabolism is an important intersection between the carbon and the nitrogen metabolism. Thus, the expression of the biosynthetic enzymes of the glutamate metabolism is highly regulated. The opposite reaction, the degradation of glutamate to 2-oxoglutarate is catalyzed by the glutamate dehydrogenase RocG. This enzyme is not capable of glutamate synthesis probably due to its low affinity for ammonium. In addition to its enzymatic function, RocG triggers the activity of the transcriptional regulator GltC that is essential for the expression of the gltAB operon encoding the glutamate synthase. In this work, mutant variants of the RocG protein were isolated and analyzed. Single amino acid exchanges uncoupled the two functions of the RocG protein. One class of mutants is severely impaired in its catalytic activity but strongly inhibits the GltC protein, thus preventing the expression of the gltAB operon. The second class completely lost the ability to inhibit GltC but retained full enzymatic activity. The data provide an insight into the regulatory mechanism of the RocG-GltC interaction. B. subtilis encodes a second glutamate dehydrogenase, GudB. In the laboratory strain 168 the gudB gene is cryptic due to a direct repeat of nine base pairs leading to a duplication of three amino acids in the active center of the enzyme. In a rocG mutant strain the gudB allele is readily decryptified upon growth on complex medium by the precise deletion of one half of the direct repeat. This work shows that the gudB mutation occurs at an extremely high rate of 10-4. Evidence was provided that a perfect direct repeat is crucial for the rapid decryptification of gudB. Moreover, by using an artificial mutagenesis system it turned out that transcription is involved in the high mutation rate of the gudB gene. Indeed, the transcription repair coupling factor Mfd is required for the decryptification of the gudB gene. The results of this work emphasize the importance of glutamate homeostasis in B. subtilis