The function of the Arabidopsis thaliana transcription factors AtbZIP1 and AtbZIP53 in reprogramming plant's metabolism during low energy stress

Energiemangelbedingungen, wie sie während langanhaltender Dunkelheit auftreten, führen zu einer massiven Umprogrammierung des pflanzlichen Metabolismus. Dies hat den Abbau von Proteinen, Aminosäuren und Nukleinsäuren sowie die Hydrolyse von Polysacchariden und Oxidation von Fettsäuren zur Folge, die unter diesen Bedingungen als alternative Energiequellen genutzt werden. Zentrale Regulatoren dieser pflanzlichen Anpassung an Energiemangel sind die SnRK1 (Snf1 RELATED KINASES) Kinasen KIN10 und KIN11. In dieser Arbeit werden die beiden bZIP (basic leucine zipper) Transkriptionsfaktoren (TF) AtbZIP1 und AtbZIP53 identifiziert, die ein Teil dieses SnRK1 Signalweges sind. Besonders AtbZIP1, aber auch AtbZIP53, werden sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell durch Energiemangel aktiviert. Die Überexpression von AtbZIP1 und AtbZIP53 führt zu einem verfrühten Eintritt in die dunkelinduzierte Seneszenz. Unter diesen Bedingungen kommt es in den Überexpremierern zu einem verstärkten Abbau von Aminosäuren wie Prolin, Leucin, Isoleucin und Valin. Die Aminosäure Asparagin, die als Transportform für Kohlenstoff und Stickstoff unter Mangelbedingungen dient, wird dagegen in AtbZIP53 Überexpremierern verstärkt gebildet. Dagegen werden in den AtbZIP53 Überexpressionspflanzen die Stärke- und Saccharosereserven trotz Energiemangel nur begrenzt als Energiequelle genutzt. Die Unterschiede in den Metaboliten des Primärstoffwechsels zwischen Überexpremierern und Wildtyp kommen durch eine veränderte Genexpression zustande. Gene wie PROLIN DEHYDROGENASE (ProDH) und BRANCHED CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE 2 (BCAT2), deren Genprodukte zum Abbau von Aminosäuren führen, werden in beiden Überexpremierern ebenso transkriptionell aktiviert wie die ASPARAGIN SYNTHETASE 1 (ASN1) und andere Gene der Asparagin Biosynthese. Gene, die für Enzyme des Lipidabbaus wie verschiedene Lipasen und Lipoxygenasen codieren, werden in beiden Überexpremierern aktiviert, während die Genexpression stärkeabbauender Enzyme wie der ß-AMYLASE5 (BAM5), vor allem in den AtbZIP53 Überexpremierern stark reduziert ist. ChIP (Chromatin Immunopräzipitation) Analysen belegen eine direkte Bindung von AtbZIP1 und AtbZIP53 an die Promotoren von ProDH und ASN1. In Experimenten mit Promotormutanten konnte zudem gezeigt werden, dass typische bZIP-Bindestellen wie eine G-Box im ASN1 Promotor und zwei ACTCAT Motive im ProDH Promotor essentiell für die Induktion dieser Gene unter Energiemangelbedingungen sind. Da die bZIP TF teilweise redundante Funktionen übernehmen, zeigen "loss-of-function"-Ansätze mit Einzelmutanten von AtbZIP1 und AtbZIP53 oder der Doppelmutante atbzip1 atbzip53 in der Expression ihrer Zielgene nur geringe Unterschiede zum Wildtyp. Vierfachmutanten von AtbZIP1 und AtbZIP53 mit je zwei der vier heterodimerisierenden Gruppe C Faktoren führen dagegen zu einer deutlichen Reduktion der dunkelinduzierten Expression von ProDH, BCAT2 und ASN1. Versuche zur Energieverarmung im Protoplastensystem zeigen deutlich den Einfluss der Kinasen KIN10 und KIN11 auf die Expression von ASN1 und ProDH. Co-Expression der Kinasen mit AtbZIP1 und AtbZIP53 hat einen synergistischen Effekt auf die Aktivierung der beiden Gene, was zeigt, dass AtbZIP1 und AtbZIP53 Teil des kinaseabhängigen Signalweges zur Aktivierung von ASN1 und ProDH unter Energiemangelbedingungen sind. Durch Mutation putativer SnRK1-Phosphorylierungsmotive in der Aminosäuresequenz von AtbZIP1 und AtbZIP53 kann aber eine Aktivierung durch eine direkte Phosphorylierung an diesen Motiven ausgeschlossen werden. Die Mutation von in vivo phosphorylierten Serinen ihres Heterodimerisierungspartners AtbZIP63 führt allerdings zu einer deutlichen Reduktion der KIN10 vermittelten ProDH-Aktivierung. Es wird deshalb postuliert, dass die SnRK1-Kinasen Heterodimere des C/S1-Netzwerks posttranslational aktivieren und so zur Änderung der Genexpression und damit zur Umprogrammierung des Metabolismus unter Energiemangelbedingungen beitragen.Energy deprivation, induced for example by long periods of darkness, leads to dramatic reprogramming of the plant's metabolism. Macromolecules like proteins, amino acids, fatty acids, polysaccharides and nucleic acids are degraded and used as alternative energy source under these carbon limiting conditions. Two central regulators of this metabolic adjustment are the SnRK1 (Snf1 RELATED KINASES) kinases KIN10 and KIN11. In this thesis the bZIP (basic leucine zipper) transcription factors (TF) AtbZIP1 and AtbZIP53 have been identified to participate in the SnRK1 regulatory network. Low energy stress activates AtbZIP1 as well as AtbZIP53 by transcriptional and post-transcriptional mechanisms. Ectopic expression of AtbZIP1 and AtbZIP53 results in enhanced dark-induced senescence. The degradation of the amino acids proline, leucine, isoleucine and valine is strongly enhanced under these conditions, whereas asparagine, a transport molecule for carbon and nitrogen under energy limiting conditions, is synthesized in a higher amount. Starch and sucrose reservoirs are just partially used as a source of energy, particularly in AtbZIP53 overexpressing plants. Differences in the metabolite levels observed in wildtype and AtbZIP1 and AtbZIP53 overexpressors are due to a modified gene expression. Transcriptional activation of genes encoding amino acid degrading enzymes like PROLIN DEHYDROGENASE (ProDH) and BRANCHED CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE 2 (BCAT2) as well as the expression of genes leading to the biosynthesis of asparagine, like the ASPARAGIN SYNTHETASE 1 (ASN1), is enhanced in the overexpressing plants. Furthermore expression of lipase and lipoxygenase genes, being part of lipid degradation pathways, is enhanced by overexpression of AtbZIP1 and AtbZIP53. In contrast, gene expression of starch degrading enzymes like the ß-AMYLASE5 (BAM5) is strongly reduced in AtbZIP53 overexpressing plants. ChIP (chromatin immunoprecipitation) analyses confirm the direct binding of AtbZIP1 and AtbZIP53 to promoters of key metabolic genes, such as ProDH and ASN1. Using promotor deletion constructs of ASN1 and ProDH, G-box and ACT-motives (ACTCAT) are defined as crucial regulatory cis-elements in the starvation response. Single or double loss-of-function mutants of AtbZIP1 and AtbZIP53 do not affect starvation-induced transcription due to redundancy of the bZIP TFs. However, quadruple mutants of the group S1 bZIP TFs AtbZIP1 and AtbZIP53 with their group C heterodimerisation partners display a significant impairment in dark induced expression of ProDH, BCAT2 and ASN1. Expression of the kinases KIN10 and KIN11 in energy deprivation experiments in protoplast, leads to a strong activation of ASN1 and ProDH. Co-expression of KIN10/11 and AtbZIP1 or AtbZIP53 has a synergistic effect on ProDH and ASN1 gene activation, demonstrating that AtbZIP1 and AtbZIP53 are part of the kinase dependent signalling pathway leading to the activation of ASN1 and ProDH under low energy stress. Mutations in putative phosphorylation sites of AtbZIP1 and AtbZIP53 do not lead to a reduction of target gene expression. Therefore KIN10/11 dependent activation of both bZIP factors by direct phosphorylation at these sites can be excluded. However, mutation of in vivo phosphorylation sites in the AtbZIP1 and AtbZIP53 heterodimerisation partner AtbZIP63 leads to a significant reduction in KIN10 dependent ProDH activation. We therefore propose that SnRK1 kinases transduce low energy signals by posttranslational activation of heterodimers of the C/S1 bZIP TF network, reprogramming gene expression and primary metabolism in the starvation response