Pathogenität eines Minimalorganismus: Die Rolle von Proteinphosphorylierungen in Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae ist ein humanpathogener Organismus, der zu den Mollicutes gehört, einer Gruppe von Bakterien mit stark reduziertem Genom, welche dennoch zum eigenständigen Leben fähig sind. Die verminderte Entwicklung der Mollicutes spiegelt sich in ihren begrenzten regulatorischen Fähigkeiten der Genexpression nieder. Daher könnten posttranslationale Regulationsereignisse wichtig für M. pneumoniae sein, um sich an wechselnde Umweltbedingungen anzupassen. Unter den wenigen regulatorischen Proteinen findet man die HPr Kinase (HPrK), die das Phosphocarrier-Protein HPr am Ser-46 phosphoryliert. Dieses Phosphorylierungsereignis ist ein Hauptsignal für die Kohlenstoff-Katabolitrepression in weniger reduzierten Bakterien. Die Funktion von HPr(Ser-P) in M. pneumoniae ist jedoch unbekannt. Für die Proteinphosphatase PrpC konnte eine Beteiligung an der Dephosphorylierung von HPr(Ser-P) gezeigt werden und zusätzlich zu HPrK, kodiert das M. pneumoniae prkC-Gen für eine weitere Serin-/Threonin-Proteinkinase C.Die Untersuchung des kompletten Phosphoproteomes von M. pneumoniae mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Massenspektrometrie ergab die Identifizierung von 63 phosphorylierten Proteinen, darunter viele Enzyme des zentralen Kohlenstoffmetabolismus und Proteine mit entscheidender Bedeutung für die Adhäsion an Wirtszellen. Zusätzlich konnte für 16 Proteine der genaue Phosphorylierungsort bestimmt werden, wobei es sich um 8 Serin- und 8 Threonin-Reste handelte. Ein Phosphoproteom-Vergleich mit anderen Bakterien zeigte jedoch, dass es nur eine sehr schwache Konservierung der Phosphorylierungsorte gibt, selbst dann, wenn die gleichen Proteine in nah verwandten Organismen phosphoryliert werden. Von dieser These gibt es nur eine Ausnahme: Die Phosphorylierung von Phosphozucker-Mutasen an einem Serin-Rest, welcher in allen untersuchten Organismen von den Archaeen über Bakterien bis hin zum Menschen konserviert ist. Für die Phosphozucker-Mutase ManB aus M. pneumoniae konnte gezeigt werden, dass sich das Protein an diesem Serin-Rest autophosphoryliert. Als Schlussfolgerung lässt sich daher festhalten, dass Proteinphosphorylierungen in jedem Organismus sehr spezifisch zu sein scheinen.Für eine genauere Untersuchung des Phosphorylierungsnetzwerkes in M. pneumoniae, wurde das Phosphoproteom des Wildtyp-Stammes und drei isogener Mutanten, in denen entweder eine der beiden Proteinkinasen HPrK und PrkC bzw. die Proteinphosphatase PrpC ausgeschaltet ist, miteinander verglichen. Die Analyse des Phosphorylierungsprofiles der hprK-Mutante zeigte, dass nur HPr von HPrK phosphoryliert wird. Im Gegensatz dazu waren sechs Proteine, einschließlich dem Hauptadhesin P1 und den zwei Adhärenz-Proteinen HMW1 und HMW3, von einer Inaktivierung von PrkC beeinflusst. Des Weiteren kam es bei einem Verlust von PrpC, der antagonistisch zu PrkC wirkenden Phosphatase, zu einer stärkeren Phosphorylierung der gleichen Zielproteine. Bei der phänotypischen Untersuchung der prkC-Mutante konnte ein nicht-adhärentes Wachstum festgestellt werden, welches mit einem Verlust der Zytotoxizität gegenüber HeLa-Zellen einherging. Daraus lässt sich schließen, dass PrkC-vermittelte posttranslationale Modifikationen von Adhärenz-Proteinen essentiell für die Zelladhäsion und die Virulenz von M. pneumoniae sind.Bei der Analyse des Phosphoproteomes zeigte sich, dass viele glykolytische Enzyme phosphoryliert werden. In M. pneumoniae dient die Glykolyse als Hauptquelle für die Erzeugung von Energie mittels Substratkettenphosphorylierung. Mit Hilfe eines bakteriellen Zwei-Hybrid-Ansatzes konnte die Enolase als das zentrale glykolytische Enzym in M. pneumoniae identifiziert werden, da sie in der Lage ist, mit allen anderen Proteinen der Glykolyse direkt zu interagieren. Des Weiteren führen die meisten glykolytischen Enzyme Selbstinteraktionen aus. Die Ergebnisse verdeutlichen daher, dass sogar in einem Minimalorganismus die Glykolyse in einer sehr geordneten Art und Weise abläuft.Der natürliche Lebensraum von M. pneumoniae sind die Lungenoberflächen, welche hauptsächlich aus Phosphatidylcholin bestehen. Dieses Phospholipid kann entweder direkt in die Zellenmembran eingebaut werden oder als Vorläufer für viele zelluläre Prozesse dienen. M. pneumoniae besitzt mit MPN420 (GlpQ) und MPN566 zwei potentielle Glycerophosphodiesterasen, die in der Lage sind, deacetylierte Phospholipide zu Glycerol-3-Phosphat und Cholin zu spalten. Im Weiteren wird das gebildete Glycerol-3-Phosphat durch Enzyme des Glycerol-Metabolismus abgebaut, wobei Wasserstoffperoxid entsteht, welches entscheidend für die Zytotoxizität von M. pneumoniae ist. Biochemische Analysen zeigten, dass GlpQ eine Glycerophosphodiesterase-Aktivität besitzt, während MPN566 in vitro nicht enzymatisch aktiv ist. Die Untersuchung von Mutanten, bei denen jeweils eine der beiden Glycerophosphodiesterasen ausgeschaltet ist, ergab, dass eine Inaktivierung von mpn566 keine phänotypischen Auswirkungen zur Folge hat. Im Gegensatz dazu wies die glpQ-Mutante einen Wachstumsdefekt in Medium mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle auf. Außerdem kam es durch die Inaktivierung von GlpQ zu einem Ausbleiben der Wasserstoffperoxid-Bildung in Anwesenheit von deacetylierten Phospholipiden und einem Verlust der Zytotoxizität gegenüber HeLa-Zellen. Diese Beobachtungen zeigen, dass GlpQ wichtig für die Pathogenität von M. pneumoniae ist, aber auch für weitere Funktionen in der Zelle. In der Tat deuten vergleichende Proteom- und Transkriptom-Analysen vom Wiltyp-Stamm und der glpQ-Mutante auf eine GlpQ-abhängige Transkriptionsregulation hin, wodurch die Proteinmengen des Glycerol-Facilitators, der Untereinheit eines Metallionen-ABC-Transporters und von drei Lipoproteinen beeinflusst werden. Interessanterweise findet man bei allen GlpQ-abhängig regulierten Genen eine konservierte regulatorische Region in 5 -Richtung oberhalb des kodierenden Bereichs. Bis auf weiteres lässt sich jedoch nur spekulieren, ob GlpQ direkt oder ein Trans kriptionsfaktor, der von GlpQ gesteuert wird, für diese Regulation verantwortlich ist.Mycoplasma pneumoniae is a human pathogen that belongs to the Mollicutes, a group of bacteria with the smallest genomes that are capable of independent life. The reductive evolution of the Mollicutes is reflected by their limited regulatory features for gene expression. Thus, posttranslational regulation might be important for M. pneumoniae to adapt to environmental changes. Among the very few regulatory proteins retained is the HPr kinase (HPrK), which phosphorylates the phosphocarrier protein HPr at the Ser-46 residue. This phosphorylation event is a major signal to trigger carbon catabolite repression in less degenerated bacteria. However, the function of HPr(Ser-P) in M. pneumoniae is unknown. For the protein phosphatase PrpC, an implication in the dephosphorylation of HPr(Ser-P) could be shown. In addition to HPrK, the M. pneumoniae prkC gene encodes another serine/threonine protein kinase C.The determination of the complete phosphoproteome of M. pneumoniae by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry allowed the detection of 63 phosphorylated proteins, including many enzymes of central carbon metabolism and proteins related to host cell adhesion. It was also possible to detect 16 phosphorylation sites, among them 8 serine and 8 threonine residues. However, a comparison with the phosphoproteomes of other bacteria revealed that there is only a weak conservation of phosphorylation sites, even if the same proteins are phosphorylated in related organisms. There is only one exception: The phosphorylation of phosphosugar mutases on a conserved serine residue, which could be detected in all studied organisms from archaea and bacteria to man. In the case of the phosphosugar mutase ManB in M. pneumoniae, it could be shown that this protein undergoes autophosphorylation. In conclusion, the results indicate that protein phosphorylation seems to be highly specific for each individual organism.For a more detailed analysis of the phosphorylation network in M. pneumoniae, the phosphoproteomes of the wild type strain and of three isogenic mutants that are affected in the two protein kinases HPrK and PrkC and in the protein phosphatase PrpC were compared. Examination of the phosphorylation profile of the hprK mutant revealed that only HPr is phosphorylated by HPrK, whereas six proteins, including the major adhesin P1 and two cytadherence proteins HMW1 and HMW3, were affected by the loss of PrkC. In contrast, inactivation of PrpC that antagonizes PrkC-dependent phosphorylation resulted in more intensive phosphorylation of the same target proteins. The phenotypic characterization of prkC mutant cells revealed a nonadherent growth type along with a loss of cytotoxicity toward HeLa cells. Thus, posttranslational modification of cytadherence proteins by PrkC is essential for cell adhesion and virulence in M. pneumoniae.The phosphoproteomic analysis demonstrated that several glycolytic enzymes are subject to phosphorylation. M. pneumoniae uses glycolysis as the major pathway for the generation of energy by substrate-level phosphorylation. Using a bacterial two-hybrid approach, the enolase was identified as the central glycolytic enzyme of M. pneumoniae due to its ability to directly interact with all other glycolytic enzymes. Moreover, most of the glycolytic enzymes performed self-interactions. The results support the idea that glycolysis proceeds in a well structured manner even in a minimal organism.In its natural habitat, M. pneumoniae thrives on pulmonary surfaces that are mainly composed of phosphatidylcholine. This phospholipid can be integrated directly into the cell membrane or serve as precursor for cellular processes. M. pneumoniae possesses two potential glycerophosphodiesterases, MPN420 (GlpQ) and MPN566, that are able to cleave deacylated phospholipids to glycerol 3-phosphate and choline. Further glycerol 3-phosphate utilization by enzymes of the glycerol metabolism is crucial for the cytotoxicity of M. pneumoniae due to hydrogen peroxide release. Biochemical studies showed that GlpQ is active as a glycerophosphodiesterase, whereas MPN566 has no enzymatic activity in vitro. Mutants affected in either glycerophosphodiesterase revealed that inactivation of mpn566 did not result in any phenotype. In contrast, the glpQ mutant exhibited a growth defect in glucose-supplemented medium. Moreover, the lack of GlpQ resulted in an absence of hydrogen peroxide formation in the presence of deacylated phospholipids and a loss of cytotoxicity toward HeLa cells. These observations imply that GlpQ is important for the pathogenicity of M. pneumoniae, but also for other functions in the cell. Indeed, proteomic and transcriptomic analyses of the wild type and the glpQ mutant strain suggested a GlpQ-dependent transcription regulation, which led to higher or lower protein amounts of the glycerol facilitator, a subunit of a metal ion ABC transporter, and three lipoproteins. Interestingly, all genes subject to GlpQ-dependent control have a conserved potential cis-acting element upstream of the coding region. Nevertheless, it is open for speculation whether GlpQ or a transcription factor that is controlled by GlpQ is responsible for this regulation