Characterization of the protein phosphatase 1E (PPM1E) - Localisation and truncation in brain tissue and effects on neuronal morphology in primary neuronal culture

Die Alzheimer sche Erkrankung (Alzheimer s disease, AD) ist eine progressive, neurodegenerative Krankheit, die durch frühe Defizite im Lernen und Gedächtnis, mit letztendlichem Verlust von höheren kognitiven Funktionen, charakterisiert ist. Obwohl erhebliche Fortschritte im Verstehen der histologischen Veränderungen während der Krankheit gemacht wurden, sind alle heute zur Verfügung stehenden Therapien symptomatisch und die Mechanismen, die dem initialen Entstehen von AD zu Grunde liegen sind immer noch unklar. In einem Screen von humanem Gehirngewebe aus verschiedenen AD Stadien, wie repräsentiert durch die Braak Einstufung, ist die gehirnspezifische Proteinphosphatase 1E (PPM1E) durch ihre starke Hochregulation in frühen AD-Stadien aufgefallen. PPM1E wurde nie zuvor mit neurologischen Erkrankungen oder Demenz in Verbindung gebracht, allerdings war es bekannt, dass PPM1E die Ca2+/calmodulin-abhängigen Kinasen (CaMK) IV und II und die p21-aktivierte Kinase (PAK) 1 negativ reguliert. Diese Kinasen sind wichtige Regulatoren des Aktinzytoskeletts in dendritischen Spines und neuronalen Dendriten. Der Verlust an dendritischen Spines und Dystrophie von Dendriten kann im AD-beeinträchtigten Gehirn beobachtet werden. Eine negative Regulation der CaMKII, CaMKIV und PAK1 Kinasen könnte potentiell mit diesen frühen Veränderungen zusammenhängen. Die vorliegende Studie hat den Einfluss von PPM1E auf neuronale Morphologie in primärer Neuronenkultur evaluiert und versucht die zuvor wenig verstandene Phosphatase ausführlicher zu charakterisieren. Die vorliegende Studie zeigte, dass die Erhöhung der PPM1E mRNA Level in humanen Gehirngewebeproben in frühen Stadien der Alzheimer schen Erkrankung sich auch auf der Proteinebene widerspiegelte. PPM1E zeigte konservierte subzelluläre, prädominant zytoplasmatische Lokalisation und Proteintrunkierung in humanem Gehirngewebe in verschiedenen Braak Stadien, in Rattengehirngeweben und in maturierter, dissoziierter Rattenprimärkultur. Die subzelluläre Lokalisation von PPM1E veränderte sich graduell während der Maturierung der dissoziierten Primärkultur, von einer hauptsächlich kernbasierten Lokalisation in Richtung einer zytoplasmatischen Lokalisation in weiter maturierter Primärkultur. Außerdem war PPM1E angereichert an Stellen mit hoher Mitochondriendichte in den Dendriten der maturierten, dissoziierten hippocampalen Kultur. Obwohl vorgeschlagen worden war, dass CaMKIIα, CaMKIV and PAK1 durch PPM1E dephosphoryliert werden, hat die vorliegende Studie gefunden, dass erhöhte PPM1E Level keinen signifikanten Effekt auf den Phosphorylierungszustand der Kinase in maturierten dissoziierten Primärneuronen haben, während sie die Gesamtexpression der CaMKIV signifikant beeinflussen. Ferner hatten erhöhte Werte von PPM1E einen degenerativen Effekt auf die Anzahl von dendritischen, pilzförmigen Spines in maturierter Neuronenkultur, während Herunterregulation von PPM1E zu einer Erhöhung der Zahl von stummeligen Spines führte. Die Anzahl der Primärdendriten wurde sowohl von einer Herunter- als auch von einer Hochregulation von PPM1E in diesen dissoziierten Kulturen negativ beeinflusst. Folglich könnte eine frühe Dysregulation von PPM1E in der Alzheimer schen Erkrankung die Dendritenmorphogenese und die Morphogenese von dendritischen Spines oder deren Homöostase negativ beeinflussen. Eine Inhibition von PPM1E in früheren Alzheimer Stadien könnte den fortschreitenden kognitiven Abbau verzögern oder bestenfalls sogar stoppen. PPM1E könnte daher ein vielversprechendes neues Drug-Target für neurodegenerative Erkrankungen und besonders für AD sein.Alzheimer s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder, characterized by early deficits in learning and memory with eventual loss of higher cognitive functions. Although considerable progress in the understanding of the histological changes during the disease has been made, all therapies available today are symptomatic and the mechanisms which underly initial AD development are still unclear. In a screen of human brain tissue from different AD stages as represented by Braak staging, the brain-specific protein phosphatase 1E (PPM1E) stuck out for its strong up-regulation in early AD stages. PPM1E has not been associated with neurological disorders or dementia before, however it was reported to negatively regulate the Ca2+/calmodulin dependent kinases (CaMK) IV and II and the p21-activated kinase (PAK) 1. These kinases are important regulators of the actin cytoskeleton in dendritic spines and neuronal dendrites. The loss of dendritic spines and dystrophy of dendrites can be observed in the AD-affected brain. A negative regulation of the CaMKII, CaMKIV and PAK1 kinases might be potentially interrelated with these early changes. This study evaluated the influence of PPM1E on neuronal morphology in primary neuronal culture and aimed to characterize the previously poorly understood phosphatase in greater detail. The present study showed that the elevation of PPM1E mRNA levels in human brain samples in early stages of Alzheimer s disease was also reflected on the protein level. PPM1E exhibited conserved subcellular, predominantly cytoplasmic localization and protein truncation in human brain tissue in different Braak stages, in rat brain tissues and in mature rat dissociated primary culture. The subcellular localization of PPM1E changed gradually during maturation of the dissociated primary culture from a predominantly nuclear localization during the first week, towards a predominantly cytoplasmatic localization in more mature primary culture. Moreover PPM1E was enriched at sites of mitochondria accumulation in dendrites of mature dissociated hippocampal neurons. Although CaMKIIα, CaMKIV and PAK1 were proposed to be deposphorylated by PPM1E, the present study found that increased PPM1E levels had no significant effect on the phosphorylation state of the kinases in mature dissociated primary neurons, whereas it significantly affected the overall CaMKIV expression. Further, increased levels of PPM1E had a degenerative effect on the number of dendritic mushroom spines in mature neuronal culture, whereas downregulation of PPM1E lead to an increase in the number of stubby spines. The number of primary dendrites was negatively affected by down- as well as upregulation of PPM1E in these dissociated cultures. Consequently, an early-onset dysregulation of PPM1E in Alzheimer s disease could negatively affect the dendrite and dendritic spine morphogenesis or homeostasis. Inhibiting PPM1E in an early stage of Alzheimer s disease may delay or at best even halt the progression of cognitive decline. PPM1E might therefore provide a promising new drug target for neurodegenerative diseases and especially for A