Transcriptome analysis of <i>Arabidopsis</i> roots after infection with the fungal pathogen <i>Verticillium longisporum</i> and identification of transcriptional regulators of the pathogen response

Verticillium longisporum ist ein Xylem-besiedelnder, bodenbürtiger Pilz, welcher zu gravierenden Ertragseinbußen im Rapsanbau führt. Untersuchungen der Pflanze-Pathogen-Interaktion des auf Brassica-Arten spezialisierten Pilzes können in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana durchgeführt werden, da diese anfällig gegenüber V. longisporum ist und die bei Raps beobachteten Krankheitssymptome entwickelt. In der vorliegenden Arbeit sollten genetische Faktoren aus A. thaliana identifiziert werden, welche die Interaktion mit V. longisporum beeinflussen. Ein besonderer Fokus lag auf der Charakterisierung der frühen transkriptionellen Reaktion von A. thaliana-Wurzeln.In einem Microarray-Experiment wurden Transkripte bestimmt, die in Wurzeln einen und drei Tage nach Verticillium-Infektion differentiell exprimiert sind. Die Transkriptomanalyse zeigte, dass die Infektion eine massive transkriptionelle Reprogrammierung auslöst, wobei besonders Transkripte der biotischen Stressantwort induziert werden. Die Microarray-Daten wurden für eine Auswahl von Transkripten in einem Zeitreihen-Experiment durch qPCR validiert und für ein Transkript wurde exemplarisch mittels Luciferase-Reporter-Pflanzen eine lokale Induktion in den direkt mit Pilzmycel in Kontakt stehenden Wurzelbereichen gezeigt.Besonders Biosynthese-Gene des Phytoalexins Camalexin sind in V. longisporum-infizierten Wurzeln transkriptionell induziert. Auch biochemisch konnte in infiziertem Wurzelgewebe eine Camalexin-Akkumulation nachgewiesen werden. In Untersuchungen der Camalexin-Biosynthese-Mutanten pad3 und cyp79b2/b3 konnte nur für die cyp79b2/b3-Mutante eine verstärkte Ausprägung der durch V. longisporum-Infektion ausgelösten Krankheitssymptome gezeigt werden. In der cyp79b2/b3-Mutante ist zusätzlich die Synthese von Indol-Glucosinolaten unterbunden. Für eine Induktion von Indol-Glucosinolat-abstammenden Metaboliten während der Abwehrreaktion spricht die durch Verticillium ausgelöste transkriptionelle Induktion von CYP81F2 und der PEN2-homologen Glycosyl-Hydrolase At3g60120. Eine PEN2/CYP81F2-abhängige Metabolisierung von Indol-Glucosinolat konnte kürzlich als wichtige Komponente der Basalresistenz identifiziert werden (Bednarek et al. 2009; Clay et al. 2009).In einem weiteren Ansatz wurden Transkriptionsfaktor-Überexpressionslinien auf ihre Resistenz gegenüber V. longisporum untersucht. Unter Anwendung einer neu etablierten Transformationsroutine wurde die A. thaliana Transkriptionsfaktor ORF Überexpressions Kollektion (AtTORF-EX) erstellt. In einem Screening wurden Überexpressionslinien von Ethylene Responsiv Element Binding Factors (ERF) nach Linien durchmustert, welche resistent gegenüber systemischer Kolonisation durch V. longisporum sind. Unter den resistenten Kandidaten-Linien traten gehäuft phylogenetisch verwandte ERF-Faktoren der Gruppe IX auf.Außerdem zeigten die Überexpressionslinien der nach V. longisporum-Infektion transkriptionell induzierten Transkriptionsfaktoren ERF#105 und ANAC042 eine erhöhte Resistenz gegenüber V. longisporum. Eine qPCR-Analyse ergab, dass in den ANAC042-Überexpressionslinien die durch V. longisporum-Infektion induzierbaren Transkripte CYP71A12 und At1g26380 konstitutiv exprimiert werden.Verticillium longisporum is a soil-borne fungal pathogen causing vascular disease within a narrow host range of brassica species. It is a mayor pest in oilseed rape cultivation causing severe yield depression. Molecular studies on V. longisporum have been conducted using the model plant Arabidopsis thaliana. A. thaliana was shown to be susceptible to V. longisporum and exhibits disease symptoms similar to those observed for the natural host plant Brassica napus. The aim of the present study was the identification of genetic determinants of A. thaliana influencing the V. longisporum A. thaliana interaction, especially focusing on the characterization of early transcriptional responses of the root.Performing microarray analysis of V. longisporum infected Arabidopsis roots the transcriptional profiles one and three days post infection were determined. These transcriptome profiles reveal a massive transcriptional reprogramming. Especially, transcripts of biotic stress responses are induced and for one transcript it was shown by analyzing luciferase reporter plants that transcript induction is locally restricted to root tissue having direct contact with the fungus.Strikingly, transcripts of the Camalexin biosynthetic pathway were induced upon infection and an accumulation of Camalexin was biochemically confirmed. From the two analyzed Camalexin biosynthesis mutants pad3 and cyp79b2/b3, only cyp79b2/b3 showed enhanced disease symptom development. The cyp79b2/b3 mutant is additionally defective in indol glucosinolate biosynthesis. qPCR analysis demonstrates a V. longisporum triggered transcriptional induction of CYP81F2 and the PEN2 homologous glucosyl hydrolase At3g60120, two enzymes associated with basal defence responses elicited by fungus induced indol glucosinolate metabolism.In a gain of function approach transcriptional regulators that effect the Arabidopsis defense response towards V. longisporum infection were identified. By applying a newly established transformation routine the A. thaliana transcription factor ORF overexpression collection (AtTORF-EX) was generated. In a screening approach overexpression lines of the Ethylene Responsive Element binding Factors (ERF) were analysed for enhanced resistance against V. longisporum. Among the resistant candidate lines members of the phylogenetic group IX of the ERF factors were overrepresented.In a second approach enhanced resistance towards Verticillium could be shown for the overexpression lines of the Verticillium induced transcription factors ERF#105 and ANAC042. In the ANAC042 overexpression lines transcripts of the Verticillium inducible genes CYP71A12 and At1g26380 showed constitutive expression