Funktionelle Analyse der Insl5- und Insl6-Gene und Bestätigung der Interaktion von Pelota und dessen putativen Interaktionspartnern.

Die Ziele dieser Arbeit waren einerseits die Untersuchung der Expression und Funktion von zwei Mitgliedern der Insulin-ähnlichen Proteinfamilie, Insl5 und Insl6, und andererseits die Bestätigung der Interaktion zwischen PELO und dessen putativen Interaktionspartnern CDK2AP1, EIF3G und SRPX.Um die Effekte der Inaktivierung von Insl5 zu untersuchen, wurden Insl5-defiziente Mäuse mit hybridem C57Bl/Jx129/Sv- und mit Inzucht 129/Sv-Hintergrund generiert und analysiert. Diese Studie zeigt, dass die Abwesenheit von Insl5 in beiden genetischen Hintergründen die Gesundheit der Mäuse nicht signifikant beeinflusst. Die interessantesten Unterschiede zwischen Insl5-/- - und Wildtyp-Mäusen des hybriden genetischen Hintergrundes wurden in deren Verhalten beobachtet, besonders in der Reaktion auf nozizeptive Impulse. Insl5-/- -Mäuse zeigen eine verzögerte Latenz für antinozizeptives Verhalten und schnelleres Zurückziehen der Pfoten wegen einer Beeinträchtigung der Weiterleitung des inhibitorischen antinozizeptiven Impulses zum Rückenmark. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Insl5-Defizienz neuronale Signalwege beeinträchtigt, die entweder an der Meditation von Schmerz oder an der Balance zwischen stimulierenden und inhibitorischen Prozessen im Rückenmark beteiligt sind. Diese Hypothese wird durch das Ergebnis unterstützt, dass INSL5-Expression im zentralen Nervensystem detektiert werden konnte. INSL5 zeigte hierbei eine besonders starke Expression in den Bereichen des Gehirns, die mit der zentralen Vermittlung von antinozizeptiven Einflüssen in Verbindung gebracht werden, wie beispielsweise im Bereich des anterioren Hypothalamus/praeoptischen Bereich, in den ventralen Nuklei des periaquäduktalen Grau und in dem Nukleus in der pontinen Kölliker-Fuse.Männliche und weibliche Insl5-/- -Mäuse des Inzuchtstammes 129/Sv sind infertil. Dieser Phänotyp konnte in den Insl5-/- - Mäusen des hybriden Hintergrundes nicht beobachtet werden. Histologische Untersuchungen zeigten im isolierten Testes der Insl5-defizienten Mäuse das Vorhandensein aller Stadien der Spermatogenese. Die Anzahl der Spermatozoen, die in Insl5-/- -Mäusen in den Nebenhoden gefunden wurden, zeigte keinen signifikanten Unterschied zur Anzahl der Spermien in den Wildtyp-Mäusen. Die Analyse der Spermienparameter ergab, dass die Spermienmotilität bei den Insl5-/- -Mäusen eingeschränkt war. Histologische Untersuchungen zeigten bei den Weibchen normale Follikelentwicklung. Um den reproduktiven Defekt in infertilen Insl5-/- -Weibchen weiter zu analysieren, wurde die Anzahl der Oocyten von superovulierten und nicht-superovulierten Weibchen bestimmt. Keine signifikanten Unterschiede konnten in der Anzahl der isolierten Oocyten zwischen Insl5-/- -Mäusen und Wildtyp-Mäusen gefunden werden. Allerdings brachten die meisten Verpaarungen zwischen Insl5-/- -Weibchen und Wildtyp-Männchen an E1.5 Embryonen hervor, dass die sich im Einzellstadium befanden. Dies lässt darauf schließen, dass die Infertilität der Insl5-/- -Weibchen durch einen Defekt in der Oocytenreifung hervorgerufen wird.Der Glucoselevel der Insl5-defizienten Mäuse war signifikant höher als der der Geschwister aus der Kontrollgruppe. Die Ergebnisse des Glucosetoleranztests (GTT) lassen vermuten, dass Insl5-/- -Mäuse schlechter dazu in der Lage sind, Glucose aus dem Blut zu verstoffwechseln, und dass die fortschreitende Verschlechterung der Glucosetoleranz ein altersabhängiger Effekt ist. Allerdings zeigte die Durchführung des Insulintoleranztests (ITT), dass die Sensitivität für Insulin in Insl5-defizienten Mäusen nicht verändert ist. Anhand der Ergebnisse des GTT und des ITT vermuten wir, dass der höhere Glucoselevel der Mäuse durch eine geringere Insulinsekretion hervorgerufen wird. Diese Ergebnisse wurden durch histologische und immunhistologische Analysen unterstützt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten, dass die durchschnittliche Größe der Langerhans schen Inseln im Insl5-/- Pankreas 1,6fach kleiner war als in dem von Wildtyp-Mäusen. Außerdem war auch die Anzahl der Insulin-positiven ß-Zellen in den Langerhans schen Inseln der Insl5-/- -Mäuse signifikant reduziert. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der hohe Glucoselevel in Insl5-/- -Mäusen durch einen Defekt in der Entwicklung der Langerhans schen Inseln im Pankreas und/oder einen Defekt in der Insulinsekretion hervorgerufen wird.Analysen der Insl6-Expression zeigten, dass Insl6 hauptsächlich in männlichen Keimzellen exprimiert wird. Die Expression von Insl6 kann zuerst an Tag 15 nach der Geburt im Maus-Testis detektiert werden, wenn die erste Welle der Spermatogenese das Stadium der Pachytän-Spermatocyten erreicht. Um die Rolle von INSL6 in der Keimzellentwicklung zu untersuchen, generierten wir Insl6-defiziente Mäuse. Die Mehrzahl der männlichen Insl6-defizienten Mäuse des hybriden Hintergrundes zeigten eine eingeschränkte Fertilität, wohingegen die weiblichen Mäuse fertil waren. Die Spermienanzahl war drastisch reduziert, was möglicherweise durch eine erhöhte Apoptoserate der sich entwickelnden Keimzellen erklärt werden kann. Auch die Spermien- Motilität war stark eingeschränkt. Analyse der Keimzellentwicklung in jungen Insl6-/- -Mäusen zeigte einen Arrest der ersten Spermatogenesewelle in der späten meiotischen Prophase. Analyse der RNA zeigte eine deutliche Abnahme der Expression später meiotischer und postmeiotischer Markergene, wohingegen die Expression von frühen meiotischen Markergenen im Insl6-/- -Testis unverändert bleibt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass INSL6 für den Ablauf der Spermatogenese benötigt wird.Das dritte Ziel dieser Arbeit war die Verifizierung der Proteininteraktion zwischen pelota (PELO) und drei Proteinen: cyclin-dependent kinase 2 associated protein 1 (CDK2AP1), eukaryotic translation initiation factor 3, subunit G (EIF3G) und Sushi- repeat-containing protein X-linked (SRPX). Diese drei putativen Interaktionspartner von PELO wurden mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Screens identifiziert. Mittels Coimmunpräzipitation konnte die spezifische Interaktion von CDKAP1, EIF3G und SRPX mit PELO bestätigt werden. GST-Pull down Assays unterstützten desweiteren die spezifische Bindung von PELO mit seinen Interaktionspartnern und zeigten, dass die dritte eEF1α-ähnliche Domäne von PELO für die Interaktion mit den Partnerproteinen verantwortlich ist. Um die Spezifität der Interaktion von PELO und den putativen Interaktionspartnern weiter zu unterstützen, sowie die subzelluläre Lokalisation der interagierenden Proteine zu bestimmen, wurde ein bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC) durchgeführt. Die mittels dieser Untersuchung erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass CDK2AP1, EIF3G und SRPX je einen Proteinkomplex mit PELO bilden, die am Cytoskelett lokalisiert sind.The aims of the study were to determinate expression and function of two members of insulin like family, namely Insl5 and Insl6 and to verify the interactions between PELO and its putative partners CDK2AP1, EIF3G and SRPX.To investigate the consequence of Insl5 inactivation, Insl5-deficient mice on the hybrid C57BL/Jx129/Sv and inbred 129/Sv genetic background have been analysed. This study shown, that the absence of Insl5 in both genetic backgrounds does not significantly affect the health. The most interesting differences between Insl5-/- and wild type mice on the hybrid genetic background were observed in behaviours, especial in nociceptive behaviours. Thus, Insl5-/- mice show delayed latency for antinociceptive behaviour and show faster paw withdraw latency potentially due to impairment of descending inhibitory antinociceptive inputs to the spinal cord. These results suggest that the Insl5-deficiency impairs neuronal pathways involved in the central mediation of pain or maintenance of the balance of spinal excitatory and inhibitory processes. These findings are supported by expression analysis of INSL5 in central nervous system. INSL5 showed a particular dense expression in brain areas concerned with the central mediation of antinociception such as anterior hypothalamus/preoptic area, the ventral nuclei of the periaqueductal gray and the pontine Kölliker-Fuse nucleus.Insl5-/- mice on the inbred 129/Sv background display male and female infertility. This phenotype was not observed in the Insl5-/- mice on the hybrid background. Histological analysis of testes isolated from Insl5-deficient mice revealed the presence of all stages of spermatogenesis. Number of epididymal spermatozoas in Insl5-/- mice was not significantly different from that of wild type mice. Analysis of sperm parameters revealed that sperm of Insl5 null mice had impaired sperm motility. Histological analysis of ovaries isolated from Insl5-/- mice revealed the presence of all stages of follicle development. To further analyse the reproductive defect in infertile Insl5-/- females, the number of oocytes, collected from females after and without superovulation, were counted and no significant differences were observed between Insl5-/- and control mice. However, most E1.5 embryos collected from Insl5-/- females inseminated by wild type males were at 1-cell stage in contrast to 2 cell-stage embryos observed in control females. These results suggest that the infertility of Insl5-/- females may be due to defect in oocyte maturation.The glucose level of Insl5-deficient mice was significantly higher than in control litter mates. Results of glucose tolerance test (GTT) suggest impaired ability to metabolize glucose from bloodstream in Insl5-/- mice and that progressive defect of glucose tolerance in Insl5-/- mice is age-dependent. However, results of insulin tolerance test (ITT) revealed that sensitivity to insulin is not altered in Insl5-deficient mice. Based on the results of GTT and ITT, we suggest that the higher glucose level might reflect reduced insulin secretion in Insl5-/- mice. These findings were supported by histological and immunohistological analyses. Results of these studies revealed that the mean islet area in Insl5-/- pancreas was 1.6-fold smaller than that of wild type. Furthermore, the numbers of insulin positive ß-cells was significantly decreased in islets of Insl5-/- mice compared to control litter mates. These results suggest that the high glucose level in Insl5-/- mice might be due to defect in the developmental of pancreatic islets and/or insulin secretion.Analyses of Insl6 expression revealed that Insl6 is predominantly expressed in male germ cells. Expression of Insl6 is first detected in mouse testis at postnatal day 15, when the first wave of spermatogenesis progresses to pachytene spermatocytes. To elucidate the role of INSL6 in germ cell development, we generated Insl6-deficient mice. The majority of the Insl6-deficient males on a hybrid genetic background exhibited impaired fertility, whereas females were fertile. The sperm number was significantly reduced probably due to apoptotic events. Also the motility of spermatozoa was drastically affected. Analysis of germ cell development during the juvenile life of Insl6-/- mice, showed an arrest of first wave of spermatogenesis in late meiotic prophase. RNA analysis revealed a significant decrease in expression of late meiotic- and post meiotic-specific marker genes, whereas expression of early meiotic-specific genes remains unaffected in the Insl6-/- testes. These results demonstrated that INSL6 is required for the progression of spermatogenesis.The third aim of this study is concentrated to verify the interaction between pelota protein (PELO) and three proteins, namely cyclin-dependent kinase 2 associated protein 1 (CDK2AP1), eukaryotic translation initiation factor 3, subunit G (EIF3G) and Sushi- repeat-containing protein X-linked (SRPX). These three putative interaction partners of PELO have been identified in the yeast two-hybrid screening. Results of coimmunoprecipitation assay confirmed the specific interaction of CDKAP1, EIF3G and SRPX with PELO. GST-Pull down assay further supported the specific binding of PELO with its interaction partners and demonstrated that the third eEF1α-like domain of PELO protein is responsible for the interaction with partner proteins. To further support the specificity of interaction between PELO and its putative partners and to determine the subcellular localization of the interacting proteins, bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC) was performed. Results of BiFC assay demonstrated the cytoskeleton-associated localization of PELO and CDK2AP1, EIF3G, SRPX, respectively protein complexes