Untersuchung von früh-endosomalem 'sorting' und 'budding'

Frühe Endosomen stellen eine wichtige Sortierstation in eukaryotischen Zellen dar. Sie empfangen Transportvesikel von der Plasmamembran und vom Golgi Apparat und sortieren die darin enthaltene membrangebundene und lösliche Ladung zu verschiedenen intrazellulären Organellen. Somit sind Fusion von Transportvesikeln, Sortierung ihres Inhalts und Abschnürung von neuen Vesikeln die elementaren Funktionen von frühen Endosomen. Während endosomale Fusion gut charakterisiert ist, fehlen Kenntnisse über den Prozess der Sortierung. Generell wird von beiden Prozessen angenommen, dass sie von verschiedenen, unabhängigen Mechanismen gesteuert werden. Diese Arbeit stellt einen neuen zellfreien Assay zur Untersuchung der Sortier- und Abschnürprozesse in frühen Endosomen vor. Dabei wird die Fähigkeit des Endosoms ausgenutzt, verschiedene Vesikelinhalte (Transferrin, Cholera Toxin Untereinheit B und LDL, low-density-lipoprotein) voneinander zu trennen. Diese Trennung benötigt sowohl die Bildung von Transportvesikeln, als auch die aktive Reifung von frühen Endosomen. Der Sortier- und Abschnürprozess wird durch Reagenzien gegen Clathrin, COPI, dynamin und Aktin nicht beeinträchtigt, während Antikörper gegen den Retromer Komplex den Prozess blockieren. Darüber hinaus benötigt der Prozess die endosomalen Proteine Rab5, Phosphatidylinositol-3-Phosphat und überraschenderweise auch den Dockingfaktor EEA1. Des Weiteren wird die Funktion des N-Ethylmaleimide-sensitiven Faktors (NSF), eines bekannten Fusions-Kofaktors, benötigt, während endosomale Fusion selbst nicht erforderlich ist. Daraus wird geschlussfolgert, dass Docking und Fusion, sowie Sortierung und Abschnürung von Vesikeln auf der molekularen Ebene stark miteinander verknüpft sind, obwohl sie gegenteilige Ziele verfolgen.Early endosomes constitute a major sorting platform of eukaryotic cells. They receive endocytic carrier vesicles from the plasma membrane and trafficking vesicles from the Golgi complex and distribute both membrane-bound and soluble cargo, via vesicular carriers, to different intracellular destinations. Thus, the elementary steps underlying endosome function are fusion with incoming vesicles, cargo sorting and budding of new vesicles. While endosomal fusion is well understood, sorting is less characterized; the two processes are generally thought to be effected by different, unrelated machineries. I developed a novel cell free assay for sorting and budding from early endosomes, by taking advantage of their ability to segregate different cargoes (such as transferrin, cholera toxin subunit B, and low-density-lipoprotein, LDL). Cargo separation required both carrier vesicle formation and active maturation of the endosomes. Sorting and budding were insensitive to reagents perturbing clathrin coats, COPI coats, dynamin, and actin, but were inhibited by anti-retromer subunit antibodies. In addition, the process required the endosomal proteins Rab5, phosphatidylinositol-3-phosphate, and, surprisingly, the docking factor EEA1. It also required the function of the N-ethylmaleimide-sensitive factor (NSF), a wellknown fusion co-factor, while it did not depend on preceding fusion of endosomes. I therefore conclude that fusion, docking and sorting/budding, although serving different purposes, are strongly interconnected at the molecular level