The role of BRCA1-associated Protein in load induced cardiac hypertrophy

Die Mitogen aktivierte Protein Kinase (MAPK)-Signalkaskade reguliert entscheidende zelluläre Prozesse wie Zellwachstum, Differenzierung, Mitose und Apoptose und spielt eine wesentliche Rolle bei der kardialen Signaltransduktion und Hypertrophieentwicklung. In Vorarbeiten konnte BRCA1 associated protein 1 (BRAP) im Rahmen einer Proteomstudie als ein Protein identifiziert werden, welches in einem Tiermodell der lastinduzierten Myokardhypertrophie differenziell reguliert wird. BRAP moduliert in immortalisierten Zelllinien die Ras-abhängige Signaltransduktion von Raf zu Mek.In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von BRAP in Kardiomyozyten in vitro und in vivo untersucht. Die Stimulation der Ras-Aktivität in Kardiomyozyten führte zu einer Verringerung der detektierten BRAP-Proteinmenge nach einer Stunde, übereinstimmend mit dem publizierten Mechanismus einer Ras-abhängig induzierten Autoubiquitinylierung und Degradation von BRAP. Zur Untersuchung der Wirkung von BRAP auf die Signaltransduktion in isolierten primären Kardiomyozyten wurde BRAP durch adenoviral vermittelten Gentransfer überexprimiert und die MAPK-Aktivierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass BRAP eine dosisabhängige Hemmung der C-Raf abhängigen Mek-Aktivierung bewirkt. In vivo bewirkte die Kardiomyozyten-spezifische Überexpression von BRAP in transgenen Mäusen den Phänotyp einer ausgeprägten dilatativen Kardiomyopathie verbunden mit einer deutlich verminderten Kontraktilität und erhöhter Mortalität im Modell der BRAP-transgenen Maus. Es konnte anhand einer erhöhten Konzentration an zytoplasmatischem Cytochrom C und eines erhöhten Bax/Bcl2-Verhältnis gezeigt werden, dass es bereits vor der Entstehung der exzentrischen Hypertrophie zu einem Verlust der Integrität der Mitochondrienmembran bei den BRAP-transgenen Mäusen kam. Zur Untersuchung der Auswirkung eines Fehlens und einer Verminderung von BRAP wurde anhand eines genetrap-ES-Zellklons ein knock out-Mausmodell generiert. Es konnte gezeigt werden, dass BRAP essentielle Funktionen während der Embryonalentwicklung besitzt, da homozygote BRAP knock out Embryonen zwischen E9,5 und E10,5 sterben. Am Tag E9,5 weisen homozygote BRAP knock out Embryonen häufig eine verminderte Größe und teilweise ein verzögertes Entwicklungsstadium auf.Mittels 2D-Gelelektrophorese und Western Blot-Analyse konnte ein komplexes Muster posttranslationaler Modifikationen von BRAP gezeigt werden. Durch Immunpräzipitation von überexprimiertem BRAP und Massenspektrometrie konnten zehn verschiedene phosphorylierte Peptide von BRAP identifiziert werden, anhand derer auf mindestens zehn Phosphorylierungsstellen geschlossen werden kann. Insgesamt zeigen die erhobenen Daten, dass BRAP ein bedeutendes, komplex reguliertes Protein ist, dem eine wichtige Bedeutung bei der MAPK-Signaltransduktion im Herzen und während der Embryonalentwicklung zukommt.Mitogen activated protein kinase (MAPK) pathways are regulating important cellular processes such as growth, differentiation, mitosis and apoptosis and are highly relevant for cardiac signaling and hypertrophy. We previously reportet BRCA1 associated protein 1 (BRAP) to be differentially regulated upon load induced myocardial hypertrophy in a proteomics study. In non-cardiac cells BRAP modulates the signaltransduction from Raf to Mek, via inhibition of the scaffolding protein KSR.The aim of the study was to analyse the role of BRAP in cardiomyocytes in vitro and in vivo. Stimulation of Ras-activity in cardiomyocytes leads to a reduction of BRAP protein after one hour, consistent with a previously reported mechanism of a Ras induced autoubiquitinylation and degradation of BRAP. To examine the role of BRAP on MAPK- signaltransduction in isolated cardiomyocytes we used adenoviral transfection. Thereby we could demonstrate that overexpression of BRAP inhibits C-Raf dependent activation of Mek. Transgenic mice overexpressing BRAP cardiomyocyte specific develope severe ventricular enlargement with thinning of the ventricular walls and a profound decreased fractional shortening after five weeks of age. Bax/Bcl2-ratio and cytoplasmic Cytochrome C content were significantly increased in three week old mice indicating mitochondrial dysfunction. To examine the consequences of reduced BRAP expression we generated BRAP knock out mice from an genetrap-ES-cellclone. It could be observed that no homozygous mice are borne and we could determinate the developmental arrest at E9.5-E10.5. Homozygous embryos were smaller and some are not fully turned at E9.5.Using 2D-gelelectrophoresis and western blot we could demonstrate a complex pattern of posttranslational modifications of BRAP. Analysing immunoprecipitated BRAP by MALDI-MS we could identify ten different phosphorylated peptides indicating at least ten phosphorylation-sites. Taken together, our results indicate that BRAP is an important complex regulated p rotein, that modulates the MAPK-signaling in the heart and during embryonic developement