Identification and immunological characterization of MHC-class-II-peptide epitopes and antigens in human leukemia- and lymphoma-associated proteins

CD4+ T-Zellen spielen durch verschiedene Mechanismen eine wichtige Rolle bei der Tumorbekämpfung. Vor allem helfen sie bei der Induktion und Aufrechterhaltung von CTL-Antworten. Tierexperimente haben gezeigt, dass Antigen-spezifische CD4+ T-Zellen wichtig für die Eliminierung von Tumoren sind. Ein interessanter Weg zur Bekämpfung von Tumoren bei Patienten liegt in der Peptid-Vakzinierung. Bisherige Anstrengungen zielten auf die Induktion von CTL-Antworten ab; um eine Verbesserung der Tumor-Vakzinierung zu erzielen, sollten CD4+ T-Zellepitope aus demselben Tumorantigen miteinbezogen werden. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, MHC Klasse-II Peptidepitope in den Proteinen zu identifizieren, welche eine tumor-assoziierte Expression aufweisen und die bereits bekannte Zielantigene von zytotoxischen T-Zellreaktionen sind. In dieser Arbeit wurden die Proteine Proteinase 3 (PR3) und Survivin (SVN) - beide Proteine werden mit Leukämien und Lymphomen in Verbindung gebracht ausgewählt. MHC Klasse-II Kandidatenepitope dieser Proteine wurden Computer-basierend vorhergesagt und als synthetische Peptide für in vitro Stimulationen mit humanen CD4+ T-Zellen eingesetzt. Peptid-spezifische CD4+ T-Zellen wurden hinsichtlich ihrer Immunreaktivität gegen das korrespondierende Tumorprotein untersucht. Mehrere Klasse-II Epitopkandidaten konnten durch Bestimmung der humanen T-Zellantwort gegen die synthetischen Peptide in SVN und PR3 identifiziert werden. Die Epitopkandidaten wurden anschließend durch die Etablierung und darauffolgende Analyse von peptid-spezifischen T-Zellklonen charakterisiert. CD4+ T-Zellen, die spezifisch für das SVN10-Epitop waren, zeigten eine proliferative Antwort gegen natürlich prozessiertes SVN-Protein. Dabei wird das SVN10-Epitop von verschiedenen HLA-DR Allelen (DR3, DR4, DR7 und DR11) präsentiert. Weiterhin konnte eine proliferative Antwort von SVN10-spezifischen T-Zellen gegen das SVN Antigen von verschiedenen Tumorzelllinien nachgewiesen werden. Die T-Zellklone wurden zudem auf ihr MHC-Restriktionsmuster, ihrem Immun-Phänotyp und ihrer Epitop-MHC-Affinität hin untersucht. Schließlich konnte auch eine CD4+ T-Zellantwort gegen SVN10 bei verschiedenen Tumorpatienten induziert werden. Somit bilden die Identifikation des natürlich prozessierten SVN-Epitops zusammen mit den bereits identifizierten Klasse-I-restringierten SVN-Epitopen die Basis für eine kombinierte Therapie, um eine wirksame und langanhaltende CD4+ und CD8+ T-Zellantwort gegen Klasse-I und II-restringierte SVN-Epitope zu induzieren. Vor kurzem wurde gezeigt, dass CD4+ regulatorische T-Zellen (Treg) eine bedeutende Rolle in der Anti-Tumor-Immunität spielen. Eine erhöhte Anzahl von CD4+ CD25+ Treg-Zellen wurde im Tumorgewebe bei Patienten mit verschiedenen Arten von Tumoren nachgewiesen. Die Untersuchungen der in dieser Arbeit generierten T-Zellklone auf spezifische T-regulatorische Marker zeigten, dass sämtliche T-Zellklone CD4+ Treg Zellen darstellen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass neue Strategien, die einerseits CD4+ Effektor T-Zellen stimulieren, andererseits CD4+ Treg-Zellen inhibieren oder depletieren, erarbeitet werden müssen um das dynamische Gleichgewicht zugunsten der Effektor- T-Zellen bei der Bekämpfung von Tumoren zu verschieben. Auf der anderen Seite kann die Expansion von Treg-Zellen die Bekämpfung von Autoimmunkrankheiten verbessern.CD4+ T cells play important roles in antitumor responses through several different mechanisms. Ultimately, they provide crucial help in the induction and maintenance of CTL responses. Experiments in animal models have demonstrated the importance of antigen-specific CD4+ T cells in the elimination of tumors. Peptide vaccination to elicit antitumor immunity remains an attractive way to treat cancer patients. Because the main effort has been to induce CTL responses, a logical way to enhance the potency of these tumor vaccines is to include CD4+ T cell epitopes for the same tumor antigen. The central goal of the work was to identify MHC class II peptide epitopes in such proteins, which exhibit a tumor-associated expression and which were already well-known target antigens of cytotoxic T cell reactions. In this work, proteinase 3 (PR3) and survivin (SVN) were selected as candidate antigens associated with leukemia and lymphoma. MHC class II candidate epitopes from these proteins were computer-assisted predicted and used as synthetic peptides for in vitro stimulation by human CD4+ T cells. Peptide specific CD4+ T cells were examined regarding their immune reactivity with the corresponding tumor protein. Several class-II epitope candidates in SVN and PR3 were identified by examining human T cell responses to synthetic peptides. Then, epitope candidates were characterized by establishing and analyzing peptide-specific T cell clones. It was demonstrated that CD4+ T cells specific for the SVN10 epitope respond to naturally processed SVN proteins. This epitope was presented by several HLA-DR alleles, including DR3, DR4, DR7, and DR11. Furthermore, the SVN10-specific T cells recognized SVN antigen from various tumor cell lines. Moreover, the T cell clones were examined for MHC restriction patterns, immunophenotypes and epitope-MHC avidity. It was further found that SVN10 was promiscuous and capable of inducing CD4+ T cell responses in cancer patients. Thus, the identification of the naturally processed SVN epitope, together with the previous finding of class I-restricted SVN epitopes, provide a basis for the combined application of class I- and II-restricted SVN epitopes to induce potent, long-term CD4+ and CD8+ T cell responses against various tumors. Lately, CD4+ T-regulatory (Treg) cells were recognized and became increasingly important in antitumor immunity. Increased proportions of CD4+ CD25+ Treg cells have been observed in patients with different types of cancers. Additional analyses of the T cell clones with Treg specific markers revealed that our CD4+ clones mainly represented regulatory T cells. In summary, new strategies that simultaneously stimulate CD4+ effector T cells while inhibiting or depleting CD4+ Treg cells are, therefore, needed to shift the dynamic equilibrium toward effector T cells in the treatment of cancer patients. The opposite approach, favouring expansion of the CD4+ Treg population, might improve the treatment of autoimmune diseases