Characterisierung der alternativen NADH Dehydrogenasen von Toxoplasma gondii

Das singuläre Mitochondrium der schnell replizierenden Tachyzoiten von Toxoplasma gondii generiert ein Membranpotential, über dessen Beitrag zum Energiestoffwechsel des Bradyzoiten- oder Ruhestadiums des Parasiten bisher wenig bekannt ist.Die steady state mRNA-Konzentration von 11 nukleär-kodierten Enzymen der Atmungskette wurde durch quantitative Real-Time RT-PCR in Tachyzoiten und Bradyzoiten untersucht. Dabei ließ sich nach Normalisierung mit ß-tubulin kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Transkriptmenge in beiden Stadien feststellen. Für Expressionsversuche wurden die offenen Leserahmen der folgenden Gene des Energiemetabolismus bestimmt und mit Hilfe der RT-PCR überprüft: (i) Alternative NADH Dehydrogenase I und II; (ii) die Flavoprotein Untereinheit der Succinat-Dehydrogenase; (iii) Cytochrom c1; und (iv) die ß-Untereinheit der ATP-Synthase. Diese Gene zeigen höchste Übereinstimmungen zu Orthologen in Plasmodium. Sie sind single-copy, nukleär-kodierte Gene, deren offene Leserahmen von multiplen Introns unterbrochen werden und N-terminale mitochondriale targeting-Sequenzen aufweisen. Die offenen Leserahmen der fünf Gene wurde mit einem C-terminalen Myc-Tag fusioniert und unter Kontrolle eines Tetracyclin-regulierbaren Promoters gebracht. Nach stabiler Transfektion der Plasmidkonstrukte in die TATi-1-Zelllinie von T. gondii und entsprechenden Kolokalisationsstudien, konnte gezeigt werden, dass die kodierten Proteine exprimiert und korrekt in das Mitochondrium transportiert werden. Die Expression und Lokalisation von TgNDH2-I und TgATP-ß wurde durch den Einsatz von Mausantiserum bestätigt, das durch Immunisation mit dem jeweiligen rekombinantem Protein gewonnen worden war. Die Überexpression dieser Proteine zeigt keinen Einfluß auf die Wachstumsrate der Parasiten.Das Genom von T. gondii enthält die typischen Komponenten der Atmungskette. Ein Komplex I (NADH:Q reductase) fehlt jedoch. An seiner Stelle konnten zwei Isoformen einer single-subunit, nicht-protonenpumpenden Alternativen NADH Dehydrogenase, TgNDH2-I und TgNDH2-II identifiziert werden. Die DNA-Sequenzen umfassen 2793 und 7686 Basenpaare und enthalten offene Leserahmen mit einer Länge von 1875 und 1974 Basenpaaren. Die beiden Gene kodieren für Präkursor-Polypeptide mit 618 bzw. 657 Aminosäuren und einem errechneten Molekulargewicht (MW) von 67 bzw. 72 kDa. Dabei zeigen die offenen Leserahmen der Isoformen eine 58 %ige Übereinstimmung der Nukleotidsequenz; ihre Genprodukte zeigen eine 43 %ige Übereinstimmung auf Aminosäureniveau. Die Tatsache, dass die Alternativen (Typ II) NADH Dehydrogenasen von T. gondii und P. falciparum in Säugetierzellen fehlen, macht sie zu einem vielversprechenden Angriffspunkt antimikrobieller Therapie. Die Chinolon-ähnliche Verbindung 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1)quinolone (HDQ) wurde vor kurzem als hoch-affiner Inhibitor Alternativer NADH Dehydrogenasen in Pilzen beschrieben. Die Hemmung durch HDQ konnte in enzymatischen Assays gezeigt werden, wobei der Inhibitor wahrscheinlich mit der Ubiquinol Bindungsstelle des Enzyms interferiert. In dieser Studie konnte in Zellkulturversuchen die Inhibition der Replikation von T. gondii dargestellt werden. Die IC50 wurde mit zwei unabhängigen Wachstumsassays bestimmt und lag zwischen ~2-8 nM. Ein besonderes Merkmal der HDQ-Struktur ist die Länge der Alkyl-Seitenkette an Position 2. Derivate mit den Alkylseitenketten C6, C8, C12 (HDQ) und C14 zeigten hervorragende anti-T. gondii Aktivität, während das C5-Derivat keine replikationshemmende Wirkung aufwies. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit ist davon auszugehen, dass 1-hydroxy-2-alkyl-4(1)quinolone mit Ubiquinonen um die selbe Bindungsstelle an der Alternativen NADH Dehydrogenase kompetitieren. In Anwesenheit von HDQ kam es in T. gondii-infizierten Kulturen zur Induktion des Bradyzoitenstadiums. Dieses Phänomen ist durch den Einsatz anderer Replikationsinhibitoren von T. gondii, die ebenfalls zur Induktion bradyzoitspezifischer Gene führen, gut bekannt. Die Kombinationsbehandlung T. gondii-infizierter Wirtszellen mit HDQ und dem Malariamittel Atovaquon, das die Ubiquinol-Oxidationsstelle von Cytochrom b in Komplex III blockiert, resultierte in einem starken synergistischen Effekt. Der Angriff zweier unterschiedlicher Orte innerhalb des mitochondrialen Ubiquinon/Ubiquinol-Zyklus erscheint somit als höchst effektive Strategie der Wachstumshemmung der Parasiten. HDQ und seine Derivate sind somit, besonders in Kombination mit Atovaquon, vielversprechende Verbindungen mit großem Potential für die Therapie der Malaria und der Toxoplasmose.Die endogenen Gene der Atmungskette sollten mit Hilfe der homologen Rekombination durch zusätzliche regulierbare Gen-Kopien ersetzt werden, um auf diese Weise induzierbare knock-out Mutanten zu generieren. Depletion von TgNDH2-I in einer konditionalen knock-out Mutante hat weder Einfluß auf die Replikationsrate noch auf die in vitro Stadienkonversion der Parasiten. Daraus läßt sich der Schluß ziehen, dass TgNDH2-II allein für die intrazelluläre Entwicklung ausreicht. Gleichzeitig konnte jedoch eine geringfügige Hochregulierung der steady state mRNA-Konzentration von TgNDH2-II in der knock-out Mutante im Vergleich zum Wildtyp festgestellt werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass TgNDH2-I depletierte Parasiten eine stark erhöhte Suszeptibilität gegenüber HDQ aufweisen: 1 nM HDQ genügte für die komplette Hemmung des Parasitenwachstums. Somit läßt sich spekulieren, dass die Über-Expression der zweiten Isoform, nämlich TgNDH2-II den Verlust von TgNDH2-I kompensiert.The single mitochondrion of Toxoplasma gondii generates a membrane potential in the proliferative tachyzoite stage. However, its contribution to energy metabolism in dormant bradyzoites is less clear.The steady state mRNA level of 11 nuclear genes coding for key subunits of the electron transport chain was quantified by quantitative real-time RT-PCR and compared in tachyzoite versus bradyzoites. No significant difference on the transcript levels between both stages was found when normalized to the expression of β-tubulin. To facilitate expression studies of energy-associated components, the open reading frame of the following genes was determined and verified by RT-PCR: (i) alternative NADH dehydrogenase I and II; (ii) flavoprotein subunit of succinate dehydrogenase; (iii) cytochrome c1; and (iv) β-subunit of ATP synthase. These genes display highest similarities to orthologs in Plasmodium. They are single copy, nuclear encoded genes with their coding sequence interrupted by multiple introns. The N-terminus of the precursor proteins has characteristics of a mitochondrial targeting pre-sequence. The open reading frame of the five genes was fused with a c-myc tag and brought under control of a tetracycline regulatable promoter. These plasmids were stably transfected into the T. gondii TATi-1 line. Co-localization studies showed that the encoded proteins are expressed and transported correctly into the mitochondrion. Expression and localization of TgNDH2-I and TgATP-β were confirmed by mouse antiserum raised against their recombinant proteins. The over-expression of these proteins has no influence on the growth rate of the parasites. The T. gondii genome predicts the presence of typical components of the respiratory chain, except complex I (NADH:Q reductase). Instead, two isoforms of a single subunit, non-proton pumping alternative NADH dehydrogenases, TgNDH2-I and TgNDH2-II, have been identified. The total DNA sequences encompass 2793 and 7686 base pairs and contain open reading frames of 1875 and 1974 base pairs, respectively. The respective genes code for a precursor polypeptides of 618 and 657 amino acid residues with a calculated MW of 67 and 72 KDa, respectively. The open reading frames encoding the isoforms show 58% nucleotide sequence identity, and their gene products share 43% amino acid sequence identity. The fact that alternative (type II) NADH dehydrogenases of T. gondii and P. falciparum are absent in mammalian cells makes them promising antimicrobial drug targets. The quinolone-like compound 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1)quinolone (HDQ) was recently described as a high affinity inhibitor of fungal alternative NADH-dehydrogenases in enzymatic assays, probably by interfering with the ubiquinol binding site of the enzyme.In this study, HDQ effectively inhibited the replication rate of T. gondii in tissue culture. The IC50 of HDQ was determined for T. gondii with two independeant types of growth assays at ~2-8 nM. An important feature of the HDQ structure is the length of the alkyl site chain at position 2. Derivatives with alkyl site chains of C6, C8, C12 (HDQ) and C14 all displayed excellent anti-T. gondii activity, while a C5 derivative completely failed to inhibit parasite replication. Due to the structural similarities, it is most likely that 1-hydroxy-2-alkyl-4(1)quinolones compete with ubiquinones for the same binding site in alternative NADH dehydrogenases. HDQ treatment of T. gondii-infected cultures resulted in an induction of bradyzoite differentiation. This effect is well known from other compounds which also inhibit parasite replication and simultaneously induce the expression of bradyzoite specific genes in T. gondii. A combined treatment of T. gondii-infected cells with HDQ and the antimalarial agent atovaquone, which blocks the ubiquinol oxidation site of cytochrom b in complex III, resulted in a strong synergism. An interference of the mitochondrial ubiquinone/ubiquinol cycle at two different locations appears thus to be a highly effective strategy to inhibit parasite replication. HDQ and derivatives represent particularly in combination with atovaquone promising compounds with high potential for anti-malarial and anti-toxoplasmal therapy. In the background of the regulatable additional copies, the endogenous genes were targeted for disruption by homologous recombination to generate inducible knock-out mutants. Depletion of TgNDH2-I in a conditional knock-out mutant has neither influence on the replication rate nor on the in vitro stage conversion, suggesting that TgNDH2-II activity is sufficient for intracellular development. However, slight upregulation of TgNDH2-II has been shown on the steady state mRNA in the knock-out mutants compared to the wild type parasites. Moreover, TgNDH2-I depleted parasites display a strongly increased susceptibility for HDQ treatment, where 1 nM HDQ was sufficient to completely inhibit parasite replication. Taken together, we tempt to speculate that the over-expression of the second isoform i.e. TgNDH2-II compensates the loss of TgNDH2-I activity